5-Ethynyl-2'-Deoxyuridine/Phospho-Histone H3 Dual-Labeling Protocol voor celcyclusprogressieanalyse in drosophila neurale stamcellen

In dit protocol geven we niet alleen een gedetailleerde uitleg van elke stap van EDU-integratie en immunostaining, maar geven we ook uitleg over beeldacquisitie, beeldverwerking en geven we enkele tips voor het analyseren van grote datasets. Deze techniek maakt de toewijzing van cellen in G1-, S- en M-fasen mogelijk. Dit zal met name nuttig zijn voor celcyclusanalyse op studies naar niet-mutaties die mitotische genen beïnvloeden.

We verwachten dat mensen twee tot drie maanden worstelen als ze geen voorkennis of ervaring hebben met deze techniek. Voeg om te beginnen Schneider’s dissectiemedium of SM toe aan twee opeenvolgende depressies van een glanzende spotplaat en voeg PBS toe aan de daaropvolgende depressie. Pluk met behulp van een tang zwervende derde instarlarven en plaats ze op een weefsel gerammeld met PBS om vliegenvoedselresten te verwijderen.

Plaats de larve in de depressie met PBS gevolgd door de opeenvolgende depressie met SM. Gebruik vervolgens onder een dissectiemicroscoop een fijne tang om driekwart van het onderlichaam van de larve te verwijderen. Pak dan voorzichtig de larvale mondhaken met één tang en houd de cuticula van het andere uiteinde vast met de andere tang. Draai de larvenkop binnenstebuiten door de mondhaken naar binnen te duwen en tegelijkertijd het weefsel aan de andere kant af te pellen.

Observeer de larvale hersenen met bevestigde denkbeeldige schijven. Verwijder andere weefsels die aan de hersenen zijn bevestigd en breng de hersenen over naar de daaropvolgende opeenvolgende depressie met SM. Voeg 100 microliter 100 micromolaire EDU SM-oplossing toe aan een andere depressie op de Pyrex-plaat en incubeer ongeveer 5 tot 10 ontleedde hersenen in deze oplossing gedurende 2 uur bij 25 graden Celsius. Verwijder na fixatie en immunostaining PBST en voeg de EDU-detectiecocktail toe aan de ontlede hersenen.

Incubeer ze vervolgens bij kamertemperatuur in het donker op een neutater. Was de monsters na 30 minuten tweemaal met PBST gedurende 10 minuten per wasbeurt in het donker. Bereid voor DNA-kleuring 5 microgram per milliliter Hoechst 33342-oplossing.

Verwijder PBST na de tweede wasbeurt en voeg 500 microliter van de Hoechst-oplossing toe aan de ontleedde hersenen en incubeer ze vervolgens in het donker. Verwijder na 10 minuten de Hoechst en was de monsters met PBST gedurende 10 minuten. Tik de buis op de laboratoriumbank en laat de hersenen tot rust komen.

Verwijder de PBST uit de buis en laat 50 tot 100 microliter achter. Snijd het uiteinde van een micropipetpunt van 200 microliter en gebruik deze om de hersenen over te brengen op een schone glasplaat. Verwijder access PBST van de dia door deze te deppen met filterpapierstroken.

Laat het filterpapier de hersenen niet raken. Plaats een druppel van een in water oplosbaar, niet-fluorescerend montagemedium op de hersenen en oriënteer de hersenen zodanig dat de ventrale zenuwstreng naar de glijbaan is gericht en de lobben naar boven gericht. Rangschik de hersenen in een enkel bestand, zodat het gemakkelijker is om de hersenen serieel in beeld te brengen.

Plaats voorzichtig een afdekslip bovenop de hersenen en incubeer de dia ‘s nachts bij 2 tot 6 graden Celsius. Selecteer uit de acquisitiesoftware de doelstelling van 63 keer. Plaats een druppel dompelolie op de afdekplaat net boven de gemonteerde hersenen om het weefsel gemakkelijker door het oculair te lokaliseren.

Gebruik het dappy Hoechst 33342-kanaal om de hersenen via het oculair te vinden en schakel vervolgens over naar de acquisitiemodus in de software. Stel 4 kanalen in om Hoechst 33342, Alexa floor 4 8 8, Alexa floor 5 6, 8 en Alexa floor 6 4 7 te bebeelden. Gebruik de kleurstofassistent om de geselecteerde kleurstofexcitatielasers en emissiefilters automatisch in te stellen.

Stel het gezichtsveld zo in dat het de hele hersenkwab omvat. Stel je het volledige volume van de hersenkwab voor door deze belasting 0,8 micron uit elkaar te krijgen. Sla alle afbeeldingen van een beeldbewerkingssessie op in een dot L I F-bibliotheekindeling.

Voor beeldanalyse opent u Fiji en sleept u de LIF-bestanden naar Fiji. Selecteer gegevensbrowser op het tabblad Stapelweergave en gebruik virtuele stapel op het tabblad Geheugenbeheer in de plug-in bio-indelingen. Observeer de meerkanaalsafbeelding die wordt weergegeven in afbeelding J. Wijzig de kleur van de kanalen in de menubalk met behulp van het gereedschap Afbeelding, Kleur en Kanalen.

En monitor de Miranda gelabelde neuroblasten, die verschijnen als grote ronde cellen in het centrale hersengebied. Teken een interessegebied met behulp van de ellipstool over elke neuroblast om te voorkomen dat de neuroblast twee keer wordt geteld. Selecteer in de J-menubalk van afbeelding de optie Analyseren, hulpprogramma’s en ROI-beheer.

Markeer alle neuroblasten in de huidige Z-sectie en druk op T na het markeren van elke cel. Zodra alle neuroblasten in de huidige Z-sectie zijn gemarkeerd, wijzigt u de kanalen in pH3 en EDU en telt u handmatig het aantal EDU-positieve neuroblasten, pH3-positieve neuroblasten, EDU- en pH3-positieve neuroblasten en neuroblasten die niet kleuren voor beide markers. Zoek naar neuroblasten en daaropvolgende Z-secties, verwijder oude ROI’s en voeg nieuwe ROI’s toe om neuroblasten in verschillende stapels te tellen.

Maak een spreadsheet en bereken percentages neuroblasten die aanwezig zijn in alle vier de categorieën voor elke kwab. Bereid een staafdiagram voor met behulp van de spreadsheetsoftware, met de poolgegevens voor percentages neuroblasten in elke categorie. Centrale hersenneuroblasten van derde instar larvale hersenen gemarkeerd met Miranda, EDU en pH3 worden hier getoond.

Cellen werden toegewezen aan G1/G0, S, SG2/M en M fasen. In EDU pH3-analyse werd een significant hoger percentage MMS19, functieverlies neuroblasten gevonden in de M-fase in vergelijking met neuroblasten van het wilde type. MMS19:eGFP-expressie in de MMS19-achtergrondverlies van functie redde het aandeel cellen in de M-fase tot wildtypeniveaus.

Het is belangrijk om geen beschadigde hersenen te gebruiken voor volgende stappen. En ED-oplossing moet vers worden bereid voordat met dissecties wordt begonnen. Deze asset kan worden gebruikt als een snelle eerste screening om defecten in specifieke celcyclusfasen te identificeren.

Dit zou dan kunnen worden gevolgd door een meer gedetailleerde analyse van een bepaalde fase.