Biochemistry
A subscription to JoVE is required to view this content.
You will only be able to see the first 2 minutes.
The JoVE video player is compatible with HTML5 and Adobe Flash. Older browsers that do not support HTML5 and the H.264 video codec will still use a Flash-based video player. We recommend downloading the newest version of Flash here, but we support all versions 10 and above.
If that doesn't help, please let us know.
دراسات التفاعلات Chaperone-Cochaperone باستخدام المتجانسة حبة القائم على المقايسة
Chapters
Summary July 21st, 2021
Please note that all translations are automatically generated.
Click here for the English version.
يقدم هذا البروتوكول تقنية للتحقيق في التفاعلات بين البروتين والبروتين باستخدام حبات المانحين المرتبطة بالجلوتاثيون مع مرافقين مشاركين من TPR-motif من GST وخرزات مقبولة إلى جانب ببتيد مشتق من Hsp90. لقد استخدمنا هذه التقنية لفحص الجزيئات الصغيرة لتعطيل تفاعلات Hsp90-FKBP51 أو Hsp90-FKBP52 وحددنا مثبطات تفاعل Hsp90-FKBP51 القوية والانتقائية.
Transcript
بنينا مقاما متجانسا قائما على الخرز لدراسة التفاعلات بين المرافقين والكوشابيرون. باستخدام هذه التقنية، نقوم بفحص الجزيئات الصغيرة التي تمنع التفاعلات بين Hsp90 و FKDP51 أو FKBP52 وتحديد مثبطات قوية وانتقائية. تقنية الفحص عالية الإنتاجية هذه قوية وموثوقة.
يمكن الحصول على النتائج في غضون ساعة واحدة، ويتطلب سوى كميات صغيرة من بروتين الخرز والمركبات. وكان التفاعل Hsp90 مع هذا cochaperones متورطة في اضطرابات بشرية، مثل مرض الزهايمر والسرطان وأمراض المناعة الذاتية. توفر هذه التقنية الفرصة لفحص مثبطات مرافق الكوشابيرون ذات الأهمية الطبية العالية.
وهنا المبدأ الأساسي لهذا المقايسة. عندما التفاعل بين Hsp90C-محطة الببتيد وتي بي آر المجال من cochaperones يجلب المانح والخرز المقبول في القرب، يتم إنشاء إشارة تضخيم للغاية. عند إضافة مثبطات التفاعل، لا يمكن للمانح والخرز المقبول الوصول إلى القرب، ولا يتم إنتاج أي إشارة يمكن اكتشافها.
تبدأ بتخفيف الببتيد Hsp90 في برنامج تلفزيوني في مليغرام واحد لكل تركيز ملليلتر. تمييع الخرز المقبول غير المترافق في PBS ، ونقل الخرز إلى أنبوب 1.5 ملليلتر. طرد مركزي الخرز المخفف لغسل، ومن ثم إزالة بعناية supernatant.
للترافق، تعيين حبات المقبول في الببتيدات بنسبة 10 إلى 1. إلى حبات paletide في برنامج تلفزيوني الببتيد المخفف، توين 20 والصوديوم cyanaboroughhydride الحل، واحتضان مع نهاية على نهاية التحريض على شاكر دوارة. لمنع المواقع غير المنقحة، إضافة 20 ميكرولتر من محلول واحد الأضراس تريس هيدروكلوريد من درجة الحموضة 8.0 إلى الخرز، وإرواء رد الفعل عن طريق احتضان لمدة ساعة واحدة في 37 درجة مئوية.
في نهاية الحضانة، اغسل الخرز عن طريق الطرد المركزي وإعادة تعليق بيليه الخرز في ملليلتر واحد من محلول ثلاثي هيدروكلوريد. كرر الغسيل مرتين أخريين. بعد الغسيل الأخير، إعادة تعليق الخرز في مليغرام واحد لكل تركيز ملليلتر في المخزن المؤقت وتخزين حل حبة المقبول المترافق في 4 درجات مئوية محمية من الضوء.
إضافة حبات المانحة الجلوتاثيون في 10 ميكروغرام لكل تركيز ملليلتر في برنامج تلفزيوني. أضف GSTFKBP51 إلى تركيز نهائي قدره 10 ميكروغرام لكل ملليلتر واحتضان التفاعل لمدة 10 دقائق عند 25 درجة مئوية في الظلام. جعل التخفيفات التسلسلية من مركب الاختبار في DMSO.
إضافة 0.25 ميكرولتر من تخفيف مركب الاختبار وثلاثة أمثال في زاوية كل بئر من لوحة بئر 384. للتحكم السلبي، أضف 0.25 ميكرولتر من DMSO وللتحكم الإيجابي، أضف 0.25 ميكرولتر من الببتيد Hsp90 C-Terminal في الآبار. إضافة 22.5 ميكرولتر من الحل الذي يحتوي على حبات المانحة الجلوتاثيون مع البروتينات الموسومة GST إلى كل بئر.
يهز لوحة جيدا مع اليدين واحتضان في الظلام في 25 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة. تمييع حبات المقبول مع الببتيد Hsp90C-Terminal المرفق إلى 100 ميكروغرام لكل تركيز ملليلتر في 0.5 مرة PBS. إضافة 2.25 ميكرولتر من حبات المقبول المخفف إلى كل بئر.
يهز واحتضان لوحة في الظلام لمدة 15 دقيقة كما هو موضح. قم بتشغيل أداة قارئ اللوحة، و قم بقياس إشارة اللوحة و قم بتحليل البيانات كما هو موضح في مخطوطة النص. إنشاء جدول بيانات س ص في الحوار الترحيب، حدد أرقام س، ص وأدخل ثلاث قيم النسخ المتماثل في الأعمدة جنبا إلى جنب.
استيراد قيم التركيز إلى العمود X وقيم الإشارة إلى العمود ص. انقر فوق تحليل، وحدد تحويل التركيز X، ثم حدد تحويل إلى لوغاريتمات. انقر فوق تحليل واختيار الانحدار غير الخطي ضمن تحليل س ص.
فتح خيار تثبيط استجابة الجرعة واختيار سجل مقابل استجابة متغير المنحدر المعادلة. انقر فوق موافق لعرض النتائج التي تحتوي على قيمة IC50 والرسوم البيانية. تم استخدام هذا المقايسة لفحص الجزيئات الصغيرة ، مما يمنع التفاعلات بين Hsp90 و FKBP51 أو FKBP52.
درجة Z من أكثر من 0.8 ونسبة الإشارة إلى الخلفية من 13.35، تثبت قوة وموثوقية لفحص الإنتاجية العالية. تم تقييم تأثير مركب اختبار الوزن الجزيئي الصغير D10 على تثبيط التفاعلات بين المرافقين والكوشابيرون وتم حساب قيم IC50 ، حيث أظهرت D10 تثبيطا يعتمد على الجرعة. كانت قيمة IC50 لتفاعلات Hsp90 GSTFKBP51 65 نانومولار.
في حين أن لHsp90، GSTFKBP52 التفاعلات، لم يتحقق تثبيط كامل مع تركيز أعلى مركب يشير إلى أنه يمكن تحقيق تثبيط انتقائي للتفاعل البروتين البروتين مع جزيئات صغيرة. والخطوة الحاسمة هي ترتيب الإضافة. نحن أول تشكيل مجمع بين جزيء صغير وهدفه TPR.
وإلا فإن الحضانة الأطول وتركيزات المركب الأعلى مطلوبة. يمكننا استخدام هذه التقنية لفحص الجزيئات الصغيرة التي تعطل التفاعل بين Hsp90 و FKB51 أو Hsp90 و FKB52. ويمكن أيضا أن تمتد إلى أي تفاعل بين Hsp90, Hsp70 و عزر TPR التي تحتوي على مثبطات فحص الكوشابيروني الانتقائية.
Related Videos
You might already have access to this content!
Please enter your Institution or Company email below to check.
has access to
Please create a free JoVE account to get access
Login to access JoVE
Please login to your JoVE account to get access
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Please enter your email address so we may send you a link to reset your password.
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Your JoVE Unlimited Free Trial
Fill the form to request your free trial.
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Thank You!
A JoVE representative will be in touch with you shortly.
Thank You!
You have already requested a trial and a JoVE representative will be in touch with you shortly. If you need immediate assistance, please email us at subscriptions@jove.com.
Thank You!
Please enjoy a free 2-hour trial. In order to begin, please login.
Thank You!
You have unlocked a 2-hour free trial now. All JoVE videos and articles can be accessed for free.
To get started, a verification email has been sent to email@institution.com. Please follow the link in the email to activate your free trial account. If you do not see the message in your inbox, please check your "Spam" folder.
