Biochemistry
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फेज प्रदर्शन का उपयोग करने के लिए E3 Ligases के लिए Ubiquitin संस्करण Modulators विकसित करने के लिए
Chapters
Summary August 27th, 2021
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एक महत्वपूर्ण प्रोटीन पोस्ट-ट्रांसलेशनल संशोधन है, जिसमें से कई मानव रोगों में फंस गया है। यह प्रोटोकॉल विवरण देता है कि कैसे फेज डिस्प्ले का उपयोग उपन्यास यूबिकिटिन वेरिएंट को अलग करने के लिए किया जा सकता है जो ई 3 लिगेस की गतिविधि को बांध और संशोधित कर सकता है जो विशिष्टता, दक्षता और पैटर्न को नियंत्रित करता है।
Transcript
फेज डिस्प्ले न केवल हमें नैदानिक रूप से महत्वपूर्ण एंजाइमों की बाध्यकारी विशेषताओं की जांच करने में मदद करता है, बल्कि उन एंजाइमों और संबंधित बीमारियों के लिए मॉड्यूलेटर भी विकसित करता है। फेज डिस्प्ले का उपयोग लक्ष्य प्रोटीन की एक विस्तृत सरणी के लिए उपन्यास बाइंडर विकसित करने के लिए किया जा सकता है और अन्य पारंपरिक प्रदर्शन विधियों की तुलना में प्रदर्शन करना भी आसान है। इस प्रक्रिया में बहुत सारी दोहरावदार कार्रवाई शामिल थी, इसलिए कुंजी ऑटोपायलट नहीं है और पूरे समय केंद्रित रहने के लिए है।
बीज संस्कृति के 200 माइक्रोलीटर के साथ 2YT टेट्रासाइक्लिन शोरबा के 30 मिलीलीटर को टीका लगाकर शुरू करें। इसे 200 आरपीएम कक्षीय झटकों के साथ 37 डिग्री सेल्सियस पर लगभग तीन घंटे के लिए इनक्यूबेट करें जब तक कि बैक्टीरिया मध्य-लॉग चरण में न हों। प्लेट से कोटिंग समाधान को सिंक में छोड़ दें।
इसे कागज के तौलिए के साथ धीरे से सुखाएं। फिर प्रत्येक लेपित अच्छी तरह से करने के लिए पीबी बफर के 200 microliters जोड़ें। प्लेट से पीबी बफर को छोड़ दें और इसे कागज के तौलिए पर सुखाएं।
प्लेट के प्रत्येक लेपित अच्छी तरह से पीबी बफर के एक और 200 माइक्रोलीटर जोड़ें। इसे 300 आरपीएम कक्षीय मिलाते हुए एक घंटे के लिए कमरे के तापमान पर इनक्यूबेट करें। बर्फ पर फेज लाइब्रेरी को पिघलाएं, फिर इसे पीबीएस में पुस्तकालय विविधता को 100X तक पतला करें।
पतला पुस्तकालय मात्रा के पांचवें हिस्से पर पॉलीथीन ग्लाइकोल सोडियम क्लोराइड समाधान जोड़ें और 30 मिनट के लिए बर्फ पर समाधान को इनक्यूबेट करें। इसके बाद, चार डिग्री सेल्सियस पर 30 मिनट के लिए 11, 000 बार जी पर समाधान को सेंट्रीफ्यूज करें। supernatant त्याग और एक और दो मिनट के लिए यह centrifuge शेष supernatant नीचे खींचने के लिए और फेज गोली ध्यान केंद्रित करने के लिए.
धीरे से विश्लेषण करने के लिए प्रति लक्ष्य प्रोटीन पीबीटी बफर के एक मिलीलीटर में फेज गोली को फिर से निलंबित कर दिया, आमतौर पर कुल में चार। नियंत्रण प्लेट में अच्छी तरह से लेपित प्रत्येक के लिए फेज लाइब्रेरी के 100 माइक्रोलीटर जोड़ें। इसे 300 आरपीएम कक्षीय मिलाते हुए एक घंटे के लिए कमरे के तापमान पर इनक्यूबेट करें।
सिंक में लक्ष्य प्लेट से पीबी बफर को छोड़ दें और कागज के तौलिए पर प्लेट को सूखा दें। नियंत्रण प्लेट में फेज लाइब्रेरी के सभी 100 माइक्रोलीटर को लक्ष्य प्लेट के प्रत्येक लेपित कुएं में स्थानांतरित करें। इसे 300 आरपीएम कक्षीय मिलाते हुए एक घंटे के लिए कमरे के तापमान पर इनक्यूबेट करें।
इसके बाद, प्लेट से फेज लाइब्रेरी को हटा दें और पीटी बफर के साथ लेपित कुओं को चार बार धोएं। प्लेट को उलटें और बफर की आखिरी बूंदों को हटाने के लिए एक पेपर तौलिया पर टैप करें। फेज को दूर करने के लिए प्रत्येक लेपित अच्छी तरह से 0.1 दाढ़ हाइड्रोक्लोरिक एसिड के 100 माइक्रोलीटर जोड़ें।
300 आरपीएम कक्षीय मिलाते हुए के साथ पांच मिनट के लिए कमरे के तापमान पर प्लेट को इनक्यूबेट करें। उसके बाद, पीएच 11 के 12.5 माइक्रोलीटर जोड़कर पीएच को बेअसर करें 11 एक दाढ़ ट्राइस हाइड्रोक्लोराइड प्रत्येक लेपित अच्छी तरह से। सभी आठ कुओं से एक एकल 1.5 मिलीलीटर माइक्रोसेंट्रिफ्यूज ट्यूब में एल्यूटेड फेज को स्थानांतरित करें।
स्थानांतरण के दौरान पिपेट ऊपर और नीचे समाधान समरूप बनाने के लिए और कुओं से सभी तरल aspirate. अंतिम एकाग्रता 1% चार डिग्री सेल्सियस पर माइक्रोसेंट्रीफ्यूज ट्यूब स्टोर करने के लिए एल्यूटेड फेज में 10% बीएसए जोड़ें। यह राउंड वन आउटपुट है।
एक आगर प्लेट से एक अलग ई कोलाई कॉलोनी के साथ 2YT tetracycline बीज संस्कृति के पांच milliliters टीका द्वारा चयन के अगले दौर के लिए फेज इनपुट culturing के लिए एक बीज संस्कृति तैयार करें। इसे 200 आरपीएम कक्षीय झटकों के साथ 37 डिग्री सेल्सियस पर रात भर इनक्यूबेट करें। पीबीएस की उचित मात्रा के साथ राउंड दो और तीन ट्यूब में लक्ष्य प्रोटीन को पतला करें।
राउंड दो और तीन ट्यूब की सामग्री का आधा हिस्सा लें और अगले दौर के लिए 96-अच्छी तरह से बाध्यकारी प्लेट में प्रति लक्ष्य प्रोटीन चार कुओं को कोट करें। अगला, मध्य-लॉग चरण कोशिकाओं के तीन मिलीलीटर को टीका लगाने के लिए राउंड वन आउटपुट के आधे हिस्से का उपयोग करें। इसे 200 आरपीएम ऑर्बिटल मिलाते हुए 30 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें।
M13KO7 सहायक फेज प्रति मिलीलीटर 10 बिलियन PFU की अंतिम एकाग्रता में जोड़ें। इसे 200 आरपीएम कक्षीय झटकों के साथ एक घंटे के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर फिर से इनक्यूबेट करें। एक घंटे के बाद, संस्कृति के पूरे तीन मिलीलीटर को 2YT कार्बेनिसिलिन कानामाइसिन समाधान के 30 मिलीलीटर में स्थानांतरित करें।
200 आरपीएम कक्षीय मिलाते हुए के साथ 37 डिग्री सेल्सियस पर रात भर बढ़ो। UBE4B के खिलाफ एक ubiquitin संस्करण चयन के लिए प्रतिनिधि परिणाम यहाँ दिखाए गए हैं। यूबीवी को उच्चतम से सबसे कम आवृत्ति तक ऑर्डर किया गया था।
अनुक्रम सभी यादृच्छिक अवशेषों के साथ UBV में विविध ubiquitin क्षेत्र का प्रतिनिधित्व करते हैं। जंगली प्रकार के लक्ष्य प्रोटीन, उत्परिवर्तित लक्ष्य प्रोटीन, साथ ही साथ ऑफ-टारगेट प्रोटीन के लिए बाइंडर्स की सापेक्ष बाध्यकारी आत्मीयता को एंजाइम-लिंक्ड इम्युनोसोर्बेंट एसेस या एलिसा द्वारा मापा जाता है। सभी एलिसा absorbances 96 औसत बीएसए एलिसा स्कोर और 96 औसत जीएसटी एलिसा स्कोर के खिलाफ सामान्यीकृत किया गया था।
गहरा हरा मजबूत सापेक्ष बंधन का प्रतिनिधित्व करता है। जीएसटी को गैर-विशिष्ट बाध्यकारी के लिए एक नियंत्रण के रूप में शामिल किया गया था क्योंकि लक्ष्य प्रोटीन जीएसटी टैग किया गया है। एलिसा परिणामों को यहां रेखांकन रूप से प्रस्तुत किया गया है।
x-अक्ष UBVs का प्रतिनिधित्व करता है और y-अक्ष संबंधित सामान्यीकृत absorbance का प्रतिनिधित्व करता है। इस प्रक्रिया का प्रयास करते समय, यह महत्वपूर्ण है कि हाइड्रोक्लोरिक एसिड जोड़ने के बाद आप प्लेट में समाधान को न छोड़ें। फेज अब समाधान में निलंबित कर दिए गए हैं और आप इन्हें रखना चाहते हैं ताकि आप बाद में संवर्धन अंतिम विश्लेषण या दोनों कर सकें।
इस प्रक्रिया के बाद, यूबीवी आवृत्तियों को निर्धारित करने के लिए अनुक्रमण किया जाना चाहिए। ELISAs और IC50 assays को क्रमशः बाध्यकारी प्रभावकारिता और निरोधात्मक प्रभावकारिता निर्धारित करने के लिए किया जा सकता है और यह निर्धारित करने में मदद करने के लिए भी किया जा सकता है कि कौन से यूबीवी को आगे चिह्नित करना है।
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