ड्रोसोफिला में घ्राण सर्किट असेंबली के टाइम-लैप्स इमेजिंग अध्ययन के लिए एक स्पष्टीकरण प्रणाली

यह प्रोटोकॉल लाइव छवि के लिए एक विधि प्रस्तुत करता है, एक विकासशील मस्तिष्क से एकल अक्षतंतु स्तर पर घ्राण सर्किट असेंबली को उड़ाता है। विकासशील मस्तिष्क को कवर करने वाले ऊतक को साफ करने के लिए विच्छेदन, हम आंतरिक मस्तिष्क से उच्च गुणवत्ता वाली छवियों को इकट्ठा कर सकते हैं। यह विधि सर्किट विकास के सेल जैविक आधार में मूल्यवान अंतर्दृष्टि प्रदान करती है।

इसे आसानी से अन्य सर्किटों के विकास का अध्ययन करने के लिए संशोधित किया जा सकता है। एक व्यक्ति को माइक्रोडिसेक्शन में स्थिर हाथ नियंत्रण करने में कुछ समय लगता है। अधिक अभ्यास सहायक होगा।

शुरू करने के लिए, पेट्री डिश की निचली सतह पर 0.5 सेंटीमीटर मोटी सिलगार्ड बिछाकर और कमरे के तापमान पर 48 घंटे के लिए इसे ठीक करने देकर समय-अंतराल इमेजिंग के दौरान स्पष्टीकरण को जुटाने के लिए संस्कृति पकवान तैयार करें। संदंश का उपयोग करके इस प्लेट पर स्पष्टीकरण को स्थिर करने के लिए माइक्रो पिन तैयार करने के लिए, एक तरफ संरेखित तेज सिरों के साथ एक टेप पर कई माइक्रो पिन चिपकाएं और कैंची के साथ दो मिलीमीटर तेज सिरों को काटें। फिर संदंश का उपयोग करके, एक पूर्व-निर्मित सिलगार्ड प्लेट की सिलगार्ड परत में कटे हुए माइक्रो पिन डालें।

एक ब्रश का उपयोग करके, सफेद प्यूपे एकत्र करें, जो एक घंटे के भीतर प्यूपेरियम बनाता है और उन्हें एक नई शीशी में स्थानांतरित करता है। यादृच्छिक प्रकार से विरल ओआरएन क्लोन को प्रेरित करने के लिए 40 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर टेम्पर्ड पानी के स्नान में प्यूपे को इनक्यूबेट करें। गर्मी के झटके के बाद, शीशी को 30 घंटे के लिए 25 डिग्री सेल्सियस पर रखें, जिसके परिणामस्वरूप प्यूपेरियम गठन के 30 घंटे बाद प्यूपे की आयु हो जाती है।

फिर पाठ पांडुलिपि में वर्णित स्पष्टीकरण के लिए संस्कृति माध्यम तैयार करें और चार डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें। इमेजिंग के दिन, भ्रूण गोजातीय सीरम, मानव इंसुलिन स्टॉक समाधान, और 20 hydroxyecdysone स्टॉक समाधान जोड़ें इथेनॉल में 50 मिलीलीटर शीशी में भंग हो जाते हैं जिसमें श्नाइडर के ड्रोसोफिला माध्यम के 45 मिलीलीटर होते हैं। अच्छी तरह से मिलाएं और एक नए 50 मिलीलीटर शंक्वाकार ट्यूब में पूर्ण माध्यम के 15 मिलीलीटर स्थानांतरित करें और एक सप्ताह के लिए चार डिग्री सेल्सियस पर पूरे माध्यम के बाकी हिस्सों को स्टोर करें।

फिर पैराफिन फिल्म के साथ पूर्ण माध्यम युक्त ट्यूबों को खोलने और 20 से 30 मिनट के लिए प्रति सेकंड एक बुलबुले की दर से एक बाँझ पांच मिलीलीटर पिपेट टिप के माध्यम से तरल सतह के नीचे ऑक्सीजन बुलबुले पंप करके माध्यम को ऑक्सीजनरेट करें। इसके बाद, विच्छेदन को अच्छी तरह से सतह पर निष्फल करें और पहले 70% इथेनॉल के साथ सिलगार्ड प्लेट तैयार करें और उन्हें उपयोग करने से पहले सूखने दें। पांच मिनट के लिए प्यूपा की बाहरी सतह को सुखाने के लिए एक टिशू पेपर में 30 घंटे एपीएफ प्यूपा को स्थानांतरित करने के लिए एक ब्रश का उपयोग करें।

एक ग्लास स्लाइड पर डबल-साइडेड टेप लागू करने के बाद, सूखे प्यूपा को टेप की चिपचिपा सतह पर सावधानीपूर्वक जोड़ा जाता है, जिसमें पृष्ठीय पक्ष ऊपर की ओर होता है। धीरे से एक ब्रश के साथ pupa दबाएँ ठीक से pupa को नुकसान पहुंचाए बिना टेप के लिए ventral पक्ष संलग्न करने के लिए. भूरे रंग के प्यूपल केस और पार्श्व पक्ष से प्यूपा के बीच संदंश की एक तेज नोक डालें और प्यूपा के पीछे के छोर पर एक रेखा के माध्यम से भूरे रंग के पिल्ला मामले को सावधानीपूर्वक तोड़ दें।

एक बार जब भूरे रंग के पिल्ला मामले को खोला जाता है, तो संदंश का उपयोग करके, धीरे से प्यूपा को पकड़ें और इसे विच्छेदन में अच्छी तरह से स्थानांतरित करें जिसमें एक मिलीलीटर ऑक्सीजन युक्त पूर्ण माध्यम होता है। प्यूपा को कुएं के नीचे तक डुबोने के लिए माध्यम में डुबोएं। प्यूपा से एंटीना मस्तिष्क के स्पष्टीकरण को विच्छेदित करने के लिए, धीरे से एक हाथ से संदंश का उपयोग करके प्यूपा को पकड़ें और माइक्रोसिस्सर की एक जोड़ी का उपयोग करके, प्यूपा के पीछे की ओर से एक छोटा छेद बनाएं, जो प्यूपा के अंदर उच्च दबाव जारी करता है।

छेद से शुरू करते हुए, गर्दन तक वेंट्रल मिडलाइन के माध्यम से काटें, फिर प्यूपा के शरीर से सिर को अलग करने के लिए गर्दन की परिधि के माध्यम से काटें और शरीर को एक अलग कुएं में रखें। इसके बाद, मस्तिष्क के शीर्ष पर वसा शरीर को उजागर करने के लिए मस्तिष्क के पृष्ठीय पक्ष को कवर करने वाले पारदर्शी छल्ली को काटें, जिससे छल्ली को रखना सुनिश्चित किया जा सके, जिसमें रेटिना और एंटीना संलग्न होते हैं और इसी तरह, मस्तिष्क के वेंट्रल पक्ष से छल्ली को काटते हैं। एक P10 पिपेट का उपयोग करके सिर के पृष्ठीय और वेंट्रल पक्षों पर खुले क्षेत्रों की ओर माध्यम को पिपेट करें ताकि मस्तिष्क और एंटीना को कवर करने वाले वसा शरीर को धीरे से धोया जा सके।

द्विपक्षीय ORN अक्षतंतु या ओआरएन अक्षतंतुओं की बातचीत का अध्ययन करने के लिए पीएन डेंड्राइट लक्ष्यीकरण के लिए, छल्ली और मस्तिष्क के बीच माइक्रोसिस्सर के ब्लेड को ध्यान से रखकर चरण के दौरान एंटीना तंत्रिका को अलग करें और रुचि रखने वाले एंटीनाल तंत्रिका को अलग करें। सिलगार्ड प्लेट में विच्छेदित स्पष्टीकरण को स्थानांतरित करने के लिए, सिलगार्ड सतह पर ऑक्सीजन युक्त पूर्ण माध्यम की लगभग 200 माइक्रोलीटर बूंद रखें। पिपेट वसा शरीर विच्छेदित ट्रंक से व्युत्पन्न कई बार एक 200 माइक्रोलीटर पिपेट टिप के माध्यम से आंतरिक सतह कोटिंग के लिए के लिए सिलगार्ड प्लेट पर मध्यम बूंद के लिए विच्छेदन से हस्तांतरण के दौरान पिपेट टिप से चिपके रहने से रोकने के लिए explants को रोकने के लिए।

दो ऑप्टिक लोब में सिलगार्ड परत पर स्पष्टीकरण को पिन करने के लिए संदंश का उपयोग करें, फिर इमेजिंग स्टेशन पर सिलगार्ड प्लेट को सावधानीपूर्वक रखें, प्लेट को टेप के साथ स्थिर करें, और धीरे-धीरे पी 1000 पिपेट का उपयोग करके सिलगार्ड प्लेट में ऑक्सीजन युक्त पूर्ण माध्यम के 10 मिलीलीटर जोड़ें। ओआरएन अक्षतंतु 18 घंटे और 36 घंटे एपीएफ के बीच एंटीनाल लोब पर पहुंचते हैं और फिर एंटीनाल लोब को नेविगेट करते हैं, मिडलाइन को पार करते हैं और ग्लोमेरुली को नवाचार करते हैं। पंजीकरण से पहले, अक्षतंतुओं ने मस्तिष्क के विकास के रूप में कुछ पार्श्व बहती हुई प्रदर्शित की, और पंजीकरण के बाद, बहती को सही किया गया था।

निकाले गए ओआरएन अक्षतंतुओं की ग्लोमेरुलर पहचान एक न्यूरोपिल मार्कर और कैडरिन के इम्यूनोस्टेनिंग द्वारा प्रकट की गई थी। आंतरिक लोब मानचित्र की तुलना करके, प्रत्येक ग्लोमेरुलस की पहचान निर्धारित की जा सकती है। पूर्व विवो संस्कृति के दौरान, बैक्टीरिया की वृद्धि आमतौर पर घ्राण सर्किट के आराम से विकास का कारण बनती है।

इसलिए, इमेजिंग से पहले सांस्कृतिक पकवान और पिन को अच्छी तरह से स्टरलाइज़ करना और इमेजिंग रूम को साफ और अलग रखना महत्वपूर्ण है। उच्च स्थानिक अस्थायी संकल्प प्राप्त करने के लिए, इस स्पष्टीकरण प्रणाली को अधिक उन्नत माइक्रोस्कोप, अनुकूली प्रकाशिकी जाली प्रकाश माइक्रोस्कोप का उपयोग करके चित्रित किया जा सकता है। यद्यपि एक कारखाने के सर्किट विकास को यहां एक उदाहरण के रूप में दिखाया गया था, इस प्रणाली को संभावित रूप से विकासशील केंद्रीय मस्तिष्क में अन्य सर्किट और विकास प्रक्रियाओं के अध्ययन के लिए विस्तारित किया जा सकता है।