Beeldvorming van moleculaire adhesie in celrollen door adhesievoetafdruktest

Dit protocol helpt bij het leggen van het verband tussen moleculaire kracht en celrolgedrag, naast het ruimtelijk in kaart brengen en kwantificeren van rollende adhesie op moleculair niveau. Deze techniek maakt het mogelijk om individuele adhesiegebeurtenissen tijdens het eigenlijke celrollen te bestuderen, waardoor we de fysiologisch relevante moleculaire adhesiekracht direct kunnen meten. Oppervlaktevoorbereiding met behulp van de juiste concentratie en incubatietijd in elke stap is cruciaal om hoogwaardige oppervlaktefunctionalisatie te bereiken.

De kwaliteit van bioconjugaties en de juiste omstandigheden zijn ook cruciaal. Visuele demonstratie is van cruciaal belang om onderzoekers te helpen dit protocol te repliceren. Met name de stappen zoals flow chamber assembly en nabewerkingsbeelden zullen veel baat hebben bij een visuele demonstratie.

Begin met het dun verspreiden van een kleine hoeveelheid epoxy aan beide zijden van de dubbelzijdige tape met een scheermesje. Knip met behulp van een laser de epoxy-gecoate tape om vier kanalen te creëren. Maak de flowchip door de epoxytape tussen een schuif met vier gaten en peg-afdekkingslip te sandwichen.

Gebruik een pipetpunt, oefen zachte druk uit over de lengte van de kanalen om een goede afdichting te creëren en laat de epoxy vervolgens minimaal een uur uitharden. Lijn de chip zo uit dat de opening van elk kanaal zich in het midden van de adapter bevindt. Plaats vervolgens twee transparante acryl afstandhouders op de chip.

Oefen stevige druk uit in het midden van het blok en schroef aan de uiteinden van elke afstandhouder. Schroef de inlaten in de schroefgaten aan de andere kant van de beugel en controleer de afdichtingsconditie door het transparante acrylblok. Stroom 200 microliter wasbuffer in de kamer om te controleren op lekkage.

Als er bubbels in het kanaal ontstaan, duw dan agressief op nog eens 200 microliter wasbuffer om de bubbels te verwijderen. Voeg 40 microliter BSA toe aan de stroomkamer om niet-specifieke binding te voorkomen en incubeer gedurende 10 minuten in de vochtigheidskamer. Voeg na incubatie 40 microliter bij Tween 20 toe aan de stroomkamer en incubeer opnieuw gedurende 10 minuten om de niet-specifieke binding verder te verminderen.

Was vervolgens het kanaal met 200 microliter wasbuffer om alle passiveringsmiddelen te verwijderen. Voeg voor de functionalisering van het kameroppervlak 40 microliter Streptavidin toe aan de stroomkamer en incubeer gedurende 20 minuten en was de kamer vervolgens met 200 microliter wasbuffer. Voeg nu 40 microliter gehybridiseerd eiwit G-TGT toe aan de stroomkamer en incubeer gedurende 20 minuten.

Voeg na het wassen met de wasbuffer 40 microliter eiwit G-TGT-bovenstreng toe en incubeer gedurende 20 minuten om elke ongehybridiseerde TGT-onderstreng op het oppervlak te voltooien en was vervolgens met wasbuffer. Voeg ten slotte 40 microliter P-selectin-Fc toe aan de stroomkamer en incubeer gedurende 60 minuten voor het wassen met wasbuffer. Vul een glazen spuit van vijf milliliter met de rolbuffer en tik op de zijkanten van de spuit om de bubbels los te maken en naar buiten te duwen terwijl ze naar de punt drijven.

Nadat u een steriele naald in een 200 millimeter stuk polyethyleenslang hebt ingebracht, sluit u de naald aan op de glazen spuit. Bevestig de spuit op de spuitpomp en kantel de spuitpomp zodanig dat de zuigerzijde verhoogd is om te voorkomen dat luchtbellen het kanaal binnendringen. Steek het uiteinde van de buis in de inlaat van de stroomkamer.

Steek het ene uiteinde van een ander stuk van 200 millimeter van de polyethyleenbuis in de uitlaat en dompel het andere uiteinde onder in een afvalbeker. Neem één tot twee milliliter van het celsuspensiemonster en centrifugeer om de cellen te pelleteren. Verwijder het medium en resuspend de cellen voorzichtig in 500 microliter van de rolbuffer.

Koppel de slang voorzichtig los van de inlaten en de uitlaat en pipetteer 40 microliter van de celsuspensie in de stroomkamer. Sluit de slang opnieuw aan zoals eerder beschreven, zodat er geen bubbels in het stroomkanaal worden gebracht. Begin het celrolexperiment door de spuitpomp met de gewenste stroomsnelheden te starten.

Observeer het rollen van cellen met behulp van een microscoop met een 10X objectief. Zodra het experiment is voltooid, verwijdert u de cellen uit het kanaal door de rolbuffer met 100 milliliter per uur te injecteren totdat het oppervlak celvrij is. Voor het in beeld brengen van de lokale sporen door DNA-PAINT, voegt u 40 microliter DNA-PAINT-beeldstreng geprepareerd in DNA-PAINT-buffer toe aan het kanaal.

Voer totale interne reflectiefluorescentiemicroscopie uit met behulp van de voorwaarden die in het tekstmanuscript worden vermeld. Lokaliseer en render de afbeeldingen met superresolutie. Voor het in beeld brengen van de lange sporen door permanente labeling, voegt u de permanente imager-streng toe en incubeert u gedurende 120 seconden in de T50M5-buffer.

Was vervolgens het kanaal door 200 microliter wasbuffer toe te voegen. Neem een afbeelding op met de excitatielaser uit om achtergrondcameraruis te verkrijgen. Stel een groot gebied in een rasterpatroon voor met TIRF-microscopie.

Programmeer de microscoop om over het gebied van 400 bij 50 afbeeldingen te scannen en splits de onbewerkte gegevens in individuele TIP-bestanden met elk maximaal 10.000 afbeeldingen met behulp van het ImageJ-programma. Vlak alle afbeeldingen af met behulp van het verlichtingsprofiel en gebruik de MIST-plug-in om de afbeeldingen te naaien. Het resultaat voor de eiwit G ssDNA bioconjugatiekarakterisering toonde een bijna één-op-één verhouding van eiwit G tot ssDNA waar het eiwit G Maleimide ssDNA en imidazoolelutiespectra van de orthogonale basis bufferen voor aanpassing aan het bioconjugatieproductspectrum.

Native PAGE werd gebruikt om de bioconjugatie te bevestigen die de felgroene banden liet zien die samenvallen met de monomere eiwit G-band, wat wijst op succesvolle conjugatie en een goede opbrengst. Het TIRF-verlichtingsprofiel dat wordt geïntroduceerd vanuit een single-mode vezel is over het algemeen helderder in het midden van het gezichtsveld en dimmer rond de randen. Om de ongelijke verlichting te compenseren en de beelden af te vlakken voor kwantitatieve analyse, werd het verlichtingsprofiel bepaald door gemiddeld duizenden individuele frames.

Afgevlakte beelden werden geproduceerd door de cameraruis af te trekken van zowel raw- als verlichtingsprofielen en vervolgens te normaliseren door het verlichtingsprofiel. Onbewerkte stiksels toonden duidelijke periodieke patronen die overeenkomen met de ongecorrigeerde afbeeldingen, terwijl hetzelfde gezichtsveld gestikt uit afgeplatte afbeeldingen een vlakke achtergrond produceerde. Een opvoerstroomprofiel werd gebruikt om het bereik van schuifspanning te bepalen, wat resulteerde in celrollen en vloeisporen opbrengen waaronder een typische eencellige adhesievoetafdruk kon worden gezien.

Suboptimale en optimale resultaten van fluorescerende sporen met onvoldoende contrast, overmatige spoordichtheid, optimale spoordichtheid en contrast, en diffractie beperkt en DNA-PAINT beeldvorming worden getoond. incubatietijd van meer dan 60 minuten zorgt voor oppervlaktefunctionalisatie en een goede kamerconstructie voorkomt de passage van bellen die het gefunctionaliseerde oppervlak beschadigen. Deze procedure is van toepassing op kwantitatieve analyse van moleculaire kracht die betrokken is bij rollende adhesie en stelt onderzoekers in staat om het rollende gedrag van de verschillende celtypen te begrijpen.

Deze techniek stelt onderzoekers in staat om nieuwe vragen te onderzoeken met betrekking tot snelle adhesiegebeurtenissen die leiden tot verdere vooruitgang van onderzoek naar één molecuul en mechanobiologie.