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Construção Manual de uma Microarray de Tecido usando o Método de Fita e um Microarrayer Portátil
Chapters
Summary June 10th, 2022
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Este protocolo descreve o método de fita sobre como construir manualmente uma microarray tecidual usando blocos de doadores FFPE de diferentes profundidades.
Transcript
A microarray tecidual, ou TMA, é uma importante ferramenta de pesquisa que reúne pequenos pedaços exemplares de tecido conhecidos como núcleos de tecido a partir de blocos de tecido incorporados parafina fixas formalina, chamados de blocos de doadores, em um único bloco de parafina. O método de fita é um método de construção totalmente manual que inverte o processo de construção, lançando o bloco em torno de núcleos eretos e, portanto, é compatível com blocos de doadores não ideais e usa microarrayers de tecido portátil descartável baratos e amplamente disponíveis. O fluxo de trabalho em várias etapas deste processo será demonstrado pelo Sr. Lee Wisner e pelo Dr. Brandon Larsen.
Um dos conceitos mais importantes a serem lembrados na construção de blocos de TMA é o fato de que tecidos em blocos de tecido incorporados parafina fixas formalina são na verdade estruturas tri=dimensionais. Desenvolvemos uma animação aqui para ajudar a explicar esse conceito. O que você está vendo aqui é uma animação representando um bloco de tecido embutido parafina fixo formalina mostrando a natureza tridimensional desse tecido dentro do bloco.
Você pode ver que o tecido é visível no topo do bloco e essa área é bastante grande. Se pudéssemos ter visão de raio-X, por assim dizer, e ver através do bloco, poderíamos ver que o tecido não é realmente uniformemente moldado mais profundamente dentro desse bloco, quase como um iceberg no oceano, onde o que você vê na superfície pode realmente não representar o que está abaixo. Dentro desse bloco tecidual pode haver pedaços de tecido adicionais que não são visíveis na superfície.
Pode haver áreas de necrose ou morte tecidual no centro desse tecido mais fundo. Um patologista deve realmente rever essa seção bidimensional fora da parte superior desse bloco tecidual e, em seguida, anotar esse slide para mostrar as áreas que contêm o tecido de interesse e excluir necrose ou outros tipos de tecido que não são realmente de interesse. Para facilitar a amostragem adequada do tecido, o patologista deve fazer três coisas.
Primeiro, usando uma caneta de marcação de slides, o patologista marcará o tecido de interesse na lâmina para que outros tecidos possam ser evitados. Em segundo lugar, se houver áreas dentro dessa área de interesse que devem ser evitadas, o patologista pode usar a mesma caneta de marcação para apagar as áreas que não devem ser amostradas. E por último, de preferência usando uma cor diferente da caneta, o patologista deve marcar as áreas ideais dentro da área de interesse para amostragem de núcleo e construção de TMA.
É importante ter em mente que quando esse processo é feito que a composição tecidual pode mudar mais profundamente dentro de onde uma amostra de núcleo é obtida e vamos mostrar isso aqui na animação, que a localização do núcleo determinará a composição desse núcleo, que vai variar pela profundidade do tecido e o que está presente dentro desse bloco. Por exemplo, aqui o primeiro núcleo que estamos ilustrando é capturar uma parte do tecido em sua metade superior, mas mais profunda dentro do bloco não há mais nenhum tecido presente de onde esse núcleo é obtido, então apenas a cera de parafina foi amostrada. O segundo núcleo que ilustramos aqui capturou tecido ao longo de toda a sua extensão porque o tecido está presente em toda a profundidade daquele bloco naquele local.
O terceiro núcleo capturou uma porção de tecido e, em seguida, capturou uma porção de cera de parafina no centro onde não havia tecido presente e, em seguida, capturou um pouco mais de tecido em sua extremidade inferior onde havia tecido na parte inferior desse bloco. Uma vez concluída a revisão patológica, compile a lista final de blocos de doadores a serem usados na construção do TMA e, em seguida, crie um mapa TMA. O mapa TMA é um delineamento esquemático onde os núcleos estarão localizados nas seções de TMA e tecido suspensas cortadas do TMA resultante.
Para fins de orientação, certifique-se de que o mapa TMA evite colocar núcleos em uma matriz uniforme, como uma matriz de três por três por quatro por quatro e inclui pelo menos um marcador de orientação. Como o método de fita inverte o processo de construção derramando cera derretida ao redor dos núcleos invertidos, isso requer a criação de um segundo mapa conhecido como mapa de construção que é uma imagem espelhada do mapa TMA. O mapa de construção mostra onde cada núcleo deve ser colocado durante a construção, a fim de aparecer no local correto no TMA concluído.
Uma vez criados os mapas, prepare o molde de base TMA metálico. Para orientar a colocação do núcleo, use uma grade de rede de verificador de papel descartável. Corte a grade quadrimedeira de papel em tamanho e afixe um pedaço de fita de dupla vara na parte de trás da grade.
Coloque a grade e a fita na bandeja de metal e adicione um segundo pedaço de fita adesiva dupla na parte superior da grade. Sobrepor o slide de H&E revisado pela patologia no bloco de tecido FFPE a ser perfurado e usar as marcas do patologista para identificar onde o bloco de tecido deve ser perfurado. Usando um soco manual manual, descartável ou reutilizável, soque o bloco de doadores FFPE na região apropriada.
Se estiver usando um soco do núcleo reutilizável, certifique-se de que ele seja limpo antes e depois de cada soco de tecido. Ejete o núcleo do soco do núcleo. Use uma picareta de agulha para colocar o núcleo ejetado na mira da grade coberta de fita dupla.
Certifique-se de que o núcleo seja colocado de forma invertida e vertical, de modo que a extremidade tecidual do núcleo entre em contato com a fita e esteja no local correto, conforme denotado pelo mapa de construção. Repita até que todos os blocos de doadores sejam corados e os núcleos sejam colocados em suas posições apropriadas. Uma vez que todos os núcleos estejam no lugar, rotule um plástico e coloque-o em cima da base metálica contendo os núcleos.
A altura dos núcleos não deve exceder a profundidade da bandeja de metal, pois os núcleos altos serão inclinados ou derrubados quando o for colocado no lugar. Despeje suavemente a parafina derretida através da fita na bandeja de núcleos. Permita que a parafina derretida transborde para garantir que não haja bolhas de ar no corpo do TMA.
Certifique-se de que a parafina encha até o topo da fita de tal forma que o esteja embutido e firmemente ligado ao bloco de parafina uma vez que ele seja solidificado. Deixe o bloco esfriar à temperatura ambiente por 30 minutos e não mova o bloco durante este tempo. Leve à geladeira o bloco a quatro graus Celsius por mais 30 minutos para solidificar completamente.
Uma vez completamente definido, separe suavemente o molde da base metálica e remova a fita de dupla adesão do bloco de parafina. Uma vez construído o TMA, use um microtome para secionar o novo TMA. Uma vez que o bloco tenha sido adequadamente enfrentado, colete seções de tecido facial completo.
Transfira as seções para um banho de água pré-aquecido e monte as seções teciduais. Uma vez seco, envie seções representativas para coloração de H&E e quaisquer manchas imunohistoquímicas adicionais que possam ser necessárias. Envie as seções de TMA manchadas para revisão patológica.
Para validação do TMA, o patologista deve rever o slide de H&E do bloco TMA e revisar cada ponto circular sob o microscópio para ver se o tecido de interesse está presente. Um componente crítico do processo de construção é a identificação de tecidos de interesse em um determinado bloco de doadores de onde o núcleo TMA deve ser obtido. A primeira coluna desta figura mostra H&Es doadores exemplares com as marcas do patologista.
A segunda coluna mostra a área perfurada dos tecidos manchados de H&E. A terceira coluna mostra o tecido manchado de H&E dos núcleos TMA que foram colhidos dos blocos de doadores nas áreas mostradas nas colunas um e dois. O patologista pode ver o bloco de doadores combinados e os H&Es do núcleo TMA juntos para validar que a área de interesse foi coletada e que a composição do tecido é a mesma.
Existem duas métricas de princípio para a conclusão bem sucedida de um TMA pelo método de fita. A primeira é a presença de pontos do núcleo de tecido nas posições esperadas e distância um do outro, que é avaliado pela inspeção visual. As imagens mostradas em A e B retratam dois TMAs do método de fita concluídos com sucesso e os slides correspondentes de H&E.
Inspeções visuais desses blocos de TMA mostram que os núcleos estão presentes e regularmente espaçados em cada TMA e suas seções correspondentes. Algumas das principais questões de construção que podem surgir durante o processo de construção do método de fita incluem a separação do bloco e do devido à remoção prematura da base metálica antes da solidificação, como mostrado na imagem C.Core toppling e/ou deriva de colocação dos núcleos incorporados como mostrado na imagem D pode ocorrer enquanto derramamento excessivamente turbulento da parafina derretida, que pode ser piorado por fita adesiva mal adesiva de dupla face. Este número mostra que a mancha de H&E para cada um dos núcleos é um TMA exemplar.
Todos, exceto um dos principais pontos, estão presentes no H&E. A figura também mostra que alguns dos núcleos estão presentes como pontos de tecido circular completo, enquanto outros não estão completamente presentes. Essa perda de tecido não é incomum e pode ser devido ao bloqueio insuficiente para revelar todos os núcleos na íntegra.
Alternativamente, a presença de tecido incompleto ou total pode decorrer da má qualidade tecidual desse núcleo, o que pode resultar em perda de tecido durante o processo de coloração. Nesta próxima figura, a imunohistoquímica e a coloração do ISH de RNA foram realizadas nas seções de TMA para validar ainda mais o TMA. Como mostrado aqui, uma variedade de manchas pode ser usada dependendo do tecido usado para construir o TMA.
Vimentin é usado como controle de qualidade. U6 é um indicador da qualidade do RNA. O EBER é usado para determinar o status EBV.
E CD20 é um marcador de células B para indicar a presença de células B. Estas são algumas manchas que podem ser usadas para ajudar a validar seu TMA. Depois de assistir a este vídeo, você deve entender como fazer uma microarray de tecido usando o método de fita e por que os TMAs são importantes ferramentas de pesquisa que economizam tempo e recursos.
Você também deve entender que a construção do TMA não é um processo ideal e que a orientação patológica contínua e a revisão são componentes críticos não apenas durante o processo de construção, mas também para estudos imunohistoquímicos realizados em seções de TMA, a fim de garantir que o tecido de interesse esteja de fato presente na seção TMA.
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