Biology
A subscription to JoVE is required to view this content.
You will only be able to see the first 2 minutes.
The JoVE video player is compatible with HTML5 and Adobe Flash. Older browsers that do not support HTML5 and the H.264 video codec will still use a Flash-based video player. We recommend downloading the newest version of Flash here, but we support all versions 10 and above.
If that doesn't help, please let us know.
Förbereda och föda upp axeniska insekter med vävnadsodlade plantor för värd-tarmmikrobiotainteraktionsstudier av bladbaggen
Chapters
Summary October 8th, 2021
Please note that all translations are automatically generated.
Click here for the English version.
För att erhålla en axenisk insekt steriliseras dess äggyta och den kläckta larven uppföds därefter med axeniska löv. Denna metod ger ett effektivt sätt för axenisk insektsberedning utan att administrera antibiotika eller utveckla en konstgjord diet, som också kan appliceras på andra bladätande insekter.
Transcript
Tarmbakterierna kan påverka flera fysiologiska processer hos insektsvärdar. Att förbereda och underhålla axenlarver är ett kraftfullt verktyg för att studera tarmbakteriers funktioner. De främsta fördelarna med detta protokoll är att växtvävnadsodling används för att erhålla bakteriefria löv till bakre axeniska bladätande insekter härledda från ytsteriliserade ägg, och att denna metod inte begränsas av konstgjorda dieter.
Denna metod är bekväm och ökar synligheten för att upprätthålla axeniska insekter för framtida tarmbakteriestudier, särskilt för icke-modellinsekter utan välutvecklade konstgjorda dieter. Håll P.versicolora-populationen i en tillväxtkammare vid 27 grader Celsius och 70% relativ luftfuktighet, med en 16 timmars ljus och åtta timmars mörk fotoperiod. Placera insekterna i perforerade plastlådor med lutat vått absorberande papper och mata dem med färska poppelgrenar.
Spraya rent vatten på absorberande papper för att bibehålla fukt och byt grenarna varannan dag. Isolera vuxna för oviposition efter valpning och mata dem ömma löv för att få fler ägg. Inom 24 timmar, samla nylagda ägg och placera dem på fuktabsorberande papper i 60 timmar för att förbereda axeniska larver.
Förbered MS-medium i ett milligram per milliliter alfa-naftalenättiksyra eller NAA-stamlösningar. I en biosäkerhetshuv, tillsätt 50 mikroliter av NAA-stamlösningen till 500 ml MS-medium och skaka för att blanda väl. Häll sedan cirka 50 ml per vävnadsodlingsbehållare och vänta på stelning.
Sterilisera skalpeller och pincett i en alkohollampa flamma i biosäkerhetshuven. Skär tre till fyra centimeter stamsegment med apikala knoppar eller sidoknoppar från poppelplantor vid ungefär en månads tillväxt och sätt in dem i odlingsmediet, ett eller två stamsegment per behållare. Inkubera dessa stamsegment i en tillväxtkammare i cirka 30 dagar.
Och använd dessa bakteriefria löv för att mata de axeniska larverna. Autoklavera petriskålar, penslar, filterpapper, destillerat vatten i en petriskål som innehåller LB-agarmedium. Lägg löv med vidhäftande ägg i en petriskål.
Ta sedan försiktigt bort äggen från bladen med pincett och överför dem till en annan petriskål. Tvätta dessa ägg med 75% etanol i åtta minuter. Upprepa sedan tvätten fyra gånger med sterilt vatten.
Överför äggen till LB-agarmedium för att bevara fukt för kläckning. Placera petriskålen i en tillväxtkammare och vänta tills äggen kläcks inom 24 timmar. I en biosäkerhetshuv, kakel tre bitar vått filterpapper i en petriskål och lägg bakteriefria poppelblad på papperet.
Samla larverna och placera dem på bladen. Försegla petriskålen med parafilm och inkubera den i en tillväxtkammare. Byt löv varannan dag.
För de konventionellt uppfödda grupperna, överför äggen från bladen till en petriskål som innehåller fuktigt filterpapper och mata dessa larver med bakteriefria poppelblad. Välj slumpmässigt ut tre första, andra och tredje instarlarver från de bakteriefria och konventionellt uppfödda grupperna. Dissekera den tredje instarlarven med steril sax och pincett under ett stereomikroskop och samla in deras tarmar i mikrocentrifugrör.
Samla intakta första och andra instar larver i rör. Tillsätt 100 mikroliter PBS och tre stålkulor till 1,5 ml-rören och slipa vävnaderna i homogenater med hjälp av en pärlslagande homogenisator. Tillsätt 100 mikroliter av homogenatet till LB-agarmedium och platta med en steril glasspridningsstång.
Inkubera plattorna vid 37 grader Celsius i 24 timmar. Observera sedan bakteriekolonierna. Extrahera det totala DNA från de tidigare erhållna vävnaderna med hjälp av ett DNA-extraktionssats och mät DNA-koncentrationen med en spektrofotometer.
Förstärk den bakteriella 16S rRNA-genen med hjälp av universella 16S rRNA-primers med PCR, vilket ställer in reaktionen enligt beskrivningen i textmanuskriptet. Förvara PCR-produkterna vid fyra grader Celsius tills vidare analys. Blanda PCR-produkterna med nukleinsyrafärgämne och analysera dem med elektrofores på en 1% agarosgel i 1X TAE-buffert.
Använd 10 mikroliter av en DNA-markör som referens. Observera gelén med en UV-transilluminator och leta efter målfragmentet runt 1 500 baspar. Även om inga bakteriekolonier observerades i någon bakteriefri grupp, observerades de i alla konventionellt uppfödda grupper, vilket indikerar att larver från steriliserade ägg som matades med vävnadsodlade poppelblad inte innehöll några bakterier.
De 1 500 baspar pcr-banden uppträdde i alla konventionellt uppfödda grupper. Däremot observerades inget band i de bakteriefria grupperna eller den negativa kontrollen, vilket innebär att inga tarmbakterier fanns i axeniska larver. För insektsarter med små ägg behövde de olika typerna av desinfektionsmedel och steriliseringstid optimeras.
Dessutom bör endofyter i vävnadsodlade växter vara anmärkningsvärda. Detta protokoll ger en ny metod för att upprätthålla bakteriefria insekter, vilket är ett praktiskt verktyg för att underlätta interaktionsstudier mellan insekter och tarmbakterier, särskilt för icke-modellinsekter utan välutvecklade konstgjorda dieter.
Related Videos
You might already have access to this content!
Please enter your Institution or Company email below to check.
has access to
Please create a free JoVE account to get access
Login to access JoVE
Please login to your JoVE account to get access
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Please enter your email address so we may send you a link to reset your password.
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Your JoVE Unlimited Free Trial
Fill the form to request your free trial.
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Thank You!
A JoVE representative will be in touch with you shortly.
Thank You!
You have already requested a trial and a JoVE representative will be in touch with you shortly. If you need immediate assistance, please email us at subscriptions@jove.com.
Thank You!
Please enjoy a free 2-hour trial. In order to begin, please login.
Thank You!
You have unlocked a 2-hour free trial now. All JoVE videos and articles can be accessed for free.
To get started, a verification email has been sent to email@institution.com. Please follow the link in the email to activate your free trial account. If you do not see the message in your inbox, please check your "Spam" folder.
