Quantificazione di specie reattive dell'ossigeno utilizzando la sonda di diacetato di 2′,7′-diclorofluoresceina e la citometria a flusso nelle cellule gliali di Müller

Esistono diversi metodi per misurare la produzione di ROS o lo stress ossidativo nelle cellule. Tra queste, la sonda 2’7’diclorofluoresceina diacetato è una delle tecniche più utilizzate per misurare direttamente lo stato redox. Questa sonda è lipofila e non fluorescente. La diffusione di questa sonda attraverso la membrana cellulare consente alle esterasi intracellulari di scindersi ai due legami estere, producendo un prodotto relativamente polare e impermeabile alla membrana cellulare. Queste molecole non fluorescenti si accumulano intracellulari e la successiva ossidazione da parte dei ROS produce il prodotto altamente fluorescente diclorofluoresceina. L’ossidazione della sonda è il prodotto dell’azione di più tipi di ROS. Che può essere rilevato mediante citometria a flusso o microscopia confocale. In questo articolo, abbiamo utilizzato una sonda di diacetato di diclorofluoresceina per misurare e quantificare ROS mediante citometria a flusso. Trasferire le piastre a 6 pozzetti in una cappa a flusso laminare dall’incubatore. Aspirare il surnatante. E lavare le cellule una volta con PBS. Aggiungere 2 ml di DMEM sierico basso per pozzetto. E incubare la piastra a 6 pozzetti per due ore nell’incubatrice. Trattare le cellule con l’antiossidante per sei ore. Trattare le cellule con l’induttore ROS, A o B, per 30 minuti. Aspirare il surnatante. E lavare la cellula tre volte con PBS per rimuovere tutti gli stimoli. Spegni la luce della cappa a flusso laminare e lavora al buio. Aggiungere 1 mL di sonda diclorofluoresceina diacetato in DMEM senza rosso fenolo. Aggiungere 1 mL di DMEM senza rosso fenolo alle celle di controllo dell’autofluorescenza di controllo. Incubare la piastra a 6 pozzetti per 30 minuti nell’incubatrice. Trasferire le piastre sul ghiaccio in laboratorio. Lavare le cellule tre volte con 2 ml di PBS freddo per pozzetto. Aggiungere 0,5 ml di tampone di distacco a freddo a ciascun pozzetto. Raccogliere le cellule tubando delicatamente su e giù usando una pipetta P1000. Raccoglieteli in un tubo da 1,5 ml etichettato. E centrifugarli a 600 x g per cinque minuti a 4 C.Scartare accuratamente il surnatante e dissociare delicatamente il pellet con la spillatura. Aggiungere 1 mL di tampone FACS per lavare le celle su ciascun tubo etichettato. Se necessario, utilizzare vortex nella più bassa intensità per la completa dissociazione del pellet. Centrifugarli a 600 x g per cinque minuti a 4 C.Ripetere questo passaggio due volte di più. Tre lavaggi in totale. Resuspend cell pellets in 200 L di tampone FACS. Dissociare delicatamente completamente il pellet in ogni tubo utilizzando vortex. E trasferire a 5 ml etichettati per provette citometriche a flusso. Tenere i tubi sul ghiaccio fino ad analizzarli sul citometro a flusso. Utilizzando il software di citometria a flusso, creare un nuovo esperimento. Fare clic sul campione e si aprirà un elenco di tubi. Fare doppio clic e rinominarli. Posizionare il tubo di controllo dell’autofluorescenza sul braccio dell’aspiratore, spostando attentamente la base solo a sinistra. Fare clic su Acquisisci dati, quindi su Registra dati e selezionare la condizione di arresto desiderata. Disegna un cancello attorno alle celle di interesse, escludendo cellule morte e detriti. Rimuovere il tubo. Fare clic su Tubo successivo ed eseguire il campione di controllo basale. Fare clic su Acquisisci dati e quindi in Registra dati.Aprire il software. Aggiungere gli esempi utilizzando il pulsante di azione Aggiungi campioni. Fare clic su Aggiungi campione.Selezionare la cartella Data sperimentale e fare clic su Scegli.Fare doppio clic sul primo campione nell’area di lavoro, in questo caso controllo di autofluorescenza. Disegna un cancello poligonale per isolare la cella di interesse, escludendo cellule morte e detriti. Cambia il grafico in un istogramma. Fare doppio clic all’interno della M