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ミュラーグリア細胞における2',7'-ジクロロフルオレセインジアセテートプローブとフローサイトメトリーを用いた活性酸素種の定量
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Summary May 13th, 2022
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ここでは、ミュラーグリア細胞(MGC)中の2',7'-ジクロロフルオレセインジアセテートプローブ(DCFH-DA)を用いて細胞活性酸素種(ROS)を検出するための、体系化され、アクセス可能で再現可能なプロトコルを提案する。この方法は、フローサイトメーターを用いて全細胞ROSレベルを定量する。このプロトコルは非常に使いやすく、適切で再現性があります。
Transcript
ROS産生、または細胞内の酸化ストレスを測定するためのいくつかの方法があります。これらの中でも、2'7'-ジクロロフルオレセインジアセテートプローブは、酸化還元状態を直接測定するために最も広く用いられている技術の一つである。このプローブは親油性であり、非蛍光性である。細胞膜を横切るこのプローブの拡散は、2つのエステル結合での細胞内エステラーゼ切断を可能にし、比較的極性が高く細胞膜非透過性の生成物を生成する。これらの非蛍光分子は細胞内に蓄積し、その後のROSによる酸化は蛍光性の高い生成物ジクロロフルオレセインを生じる。プローブの酸化は、複数のタイプのROSの作用の産物である。これは、フローサイトメトリーまたは共焦点顕微鏡によって検出することができる。この記事では、ジクロロフルオレセインジアセテートプローブを使用して、フローサイトメトリーによってROSを測定および定量しました。6ウェルプレートをインキュベーターから層流フードに移す。上清を吸引する。細胞をPBSで1回洗浄した。1ウェルあたり2mLの低血清DMEMを加える。6穴プレートをインキュベーター内で2時間インキュベートした。細胞を抗酸化物質で6時間処理する。ROS誘導物質AまたはBで細胞を30分間処理する。上清を吸引する。細胞をPBSで3回洗浄し、全ての刺激を除去した。層流フードの明かりを消し、暗闇の中で作業します。フェノールレッドを含まないDMEMに1mLのジクロロフルオレセインジアセテートプローブを加える。フェノールレッドを含まない1mLのDMEMを対照自家蛍光制御細胞に加える。6ウェルプレートをインキュベーター内で30分間インキュベートする。氷の上のプレートを実験室に移す。1ウェルあたり2mLの冷たいPBSで細胞を3回洗浄する。0.5 mL の冷剥離バッファーを各ウェルに加えます。P1000ピペットを使用して上下に静かにピペッティングして細胞を回収します。ラベルの付いた1.5 mLチューブに集めます。そしてそれらを600 x gで4°Cで5分間遠心分離し、上清を慎重に捨て、そして軽く叩いてペレットを解離させる。1mLのFACSバッファーを加え、細胞を各標識チューブに洗浄する。必要に応じて、ペレットを完全に解離させるために、最も低い強度の渦を使用してください。600 x gで4°Cで5分間遠心分離し、この手順をさらに2回繰り返します。全部で3回の洗浄。細胞ペレットを200LのFACS緩衝液に再懸濁する。渦を用いて各チューブ内のペレットを完全に穏やかに解離させる。標識した5mL用フローサイトメーターチューブに移した。フローサイトメーターで分析するまでチューブを氷上に保管してください。フローサイトメトリーソフトウェアを使用して、新しい実験を作成します。試料をクリックすると、チューブのリストが開きます。ダブルクリックして名前を変更します。自家蛍光制御チューブをアスピレーターアームの上に置き、ベースを左だけ慎重に動かします。「データ集録」をクリックし、「データを記録」をクリックして、目的の停止条件を選択します。目的の細胞の周りにゲートを描き、死んだ細胞と破片を除きます。チューブを取り外します。[次のチューブ] をクリックし、基本対照サンプルを実行します。[データの取得] をクリックし、[データの記録] をクリックします。ソフトウェアを開きます。[サンプルの追加] アクション ボタンを使用してサンプルを追加します。[サンプルの追加] をクリックします。[実験日] フォルダーを選択し、[選択] をクリックします。ワークスペース内の最初のサンプル (この場合は自家蛍光コントロール) をダブルクリックします。ポリゴン ゲートを描画して、目的のセルを分離し、死んだセルと破片を除外します。プロットをヒストグラムに変更します。M 内をダブルクリックします。
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