Biology
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Cura da ferida corneal de zebrafish: da abrasão à análise de imagem de fechamento da ferida
Chapters
Summary March 1st, 2022
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Este protocolo se concentra em danificar a superfície ocular do zebrafish através da abrasão para avaliar o subsequente fechamento da ferida no nível celular. Esta abordagem explora uma rebarba ocular para remover parcialmente o epitélio corneo e usa microscopia eletrônica de varredura para rastrear mudanças na morfologia celular durante o fechamento da ferida.
Transcript
A transparência da córnea é fundamental para limpar a visão. No contexto patológico, essa transparência pode ser um desafio. Estudar o mecanismo de patogênese requer modelos simples com alta semelhança com o órgão humano.
Nesses aspectos, o zebrafish é um excelente modelo. E esta é a primeira descrição detalhada da abrasão da córnea em zebrafish. Esta técnica é uma maneira simples e rápida de induzir a entrada superficial no olho.
O fechamento da ferida pode ser seguido facilmente após a abrasão. Além disso, produtos químicos, ou fatores específicos, podem ser adicionados à água do tanque para estudar seu impacto no fechamento da ferida. À medida que a ferida é criada manualmente, o método requer alguma prática para obter resultados consistentes.
Antes do experimento, prepare uma solução de 0,02% de trabalho de tricaine. Descongele 2 mL de 0,4% de solução de estoque. Adicione a 40 mL de água do sistema.
E coloque a solução em um recipiente pequeno. Tenha a rebarba oftálmica pronta, verificando se a ponta da rebarba está limpa. E se necessário, remova detritos celulares com um cotonete úmido.
Faça uma incisão ao lado de uma esponja macia. E umedeça a esponja com água do sistema. Coloque a esponja no palco de um microscópio dissecando.
Garanta espaço de trabalho suficiente para usar a rebarba. E iluminação suficiente de lado e acima para ver a superfície dos olhos corretamente. Coloque suavemente o peixe anestesiado com uma colher na incisão na esponja com a cabeça salientes da superfície da esponja.
Aproxime-se cuidadosamente da superfície dos olhos com a ponta da rebarba. E comece a mover a ponta na superfície dos olhos com um movimento circular. Quando a abrasão estiver feita, coloque cuidadosamente os peixes no sistema fresco de água contendo analgésico para recuperação.
Limpe a rebarba imediatamente após o uso com um cotonete úmido. Pegue o peixe no ponto de tempo desejado e coloque-o em solução 0,02%. Mantenha o animal na solução até que o movimento opercular cesse completamente e o peixe não reaja ao toque.
Coloque o peixe em uma placa de Petri com uma colher, e segure-o com pinças. Decapite o peixe com uma tesoura dissecando. Evite fazer arranhões na superfície do olho.
Coloque o tecido em um tubo de amostra contendo fosfato de sódio de 0,1 M. E enxágüe-o com um tampão limpo para que nenhum sangue permaneça na solução. Fixar o tecido em 2,5% glutaraldeído em 0,1 M de fosfato de sódio por 24 horas a 4 C.Remova a solução de fixação e enxágue a amostra várias vezes com fosfato de sódio de 0,1 M.
Disseque a amostra colocando-a em uma gota de fosfato de sódio de 0,1 M em uma placa de dissecação. Corte a amostra da cabeça em duas com uma tesoura de dissecação fina. Alternativamente, colete os olhos colocando cuidadosamente as pontas de pinças finas nas órbitas oculares a partir do lado do olho.
Em seguida, retire o olho da tomada e remova tecido extra. Transfira a amostra dissecada para um tubo contendo fosfato de sódio de 0,1 M. Certifique-se de que não há tecido extra no tubo de amostra, pois ele pode aderir ao topo do olho durante o processamento da amostra.
Coloque a montagem com a guia em um suporte. E o suporte para a base de um microscópio dissecando. Coloque suavemente a amostra de tecido no suporte com pinças finas, córnea voltada para cima.
Cubra o espécime com platina usando o dispositivo apropriado. E armazene as amostras à temperatura ambiente até a imagem. Adquira imagens da ampliação desejada.
E use imagens de 2000 a 2500x para análise. Ajuste o brilho e o contraste para ver claramente todas as bordas celulares e microcréditos. E evite áreas superexpostas na imagem.
Abra a imagem TIFF com Fiji ImageJ 1.53. E use uma barra de escala para definir a escala. Crie uma linha igual à barra de escala com a ferramenta Linha.
Selecione Analisar. Em seguida, definir escala. E digite a distância conhecida.
Em seguida, abra o gerenciador de ROI usando o menu Analisar, Ferramentas. Para selecionar tamanho de célula e arredondamento, selecione Analisar, definir medidas, descritores de forma. E use a ferramenta Lupa para ver as células sob ampliação.
Selecione células com a ferramenta Polígono e adicione cada seleção ao gerenciador de ROI. Finalmente, meça as células selecionadas e salve a medição. Para prosseguir com a análise de microarmes, certifique-se de que a imagem está em formato de 8 bits clicando no menu Imagem, Tipo.
Em seguida, selecione a célula com a ferramenta Polígono. E limpe o fundo clicando em Editar, depois Limpar para fora. Suavize a imagem uma a três vezes selecionando Process, Smooth.
E ajuste o brilho e o contraste da imagem, ajuste, brilho/contraste, para que os microcréditos se destaquem da forma mais clara possível. Convolve a imagem clicando em Process, Filters, Convolve. E transformá-lo em binário clicando em Process, Binary, Make Binary.
Em seguida, esqueleto a imagem em preto e branco selecionando Process, Binary, Skeletonize. Use a função Esqueleto Analisado para medir os parâmetros do microarem e salvar os valores. A área do ferimento está fechada a três horas após o ferimento.
Mas o local onde as bordas da ferida se juntam permanece visível. Os resultados mostraram que em microctérias de epitélio de córnea abradas podem ser observadas em algumas células alongadas próximas ao local da ferida. Em algumas regiões periféricas, os microcréditos são perdidos do centro da célula.
Uma comparação entre as duas regiões periféricas mostrou células alongadas com microcréditos médios mais curtos, indicando rearranjos celulares como reação ao ferimento. Esses resultados sugerem que as alterações de forma celular se correlacionam com a modificação da microcrélise e enfatizam a heterogeneidade dentro do epitélio córnea na resposta à ferida. Lembre-se que a operação requer treinamento para realizar uma ferida homogênea e reprodutível.
Além da microscopia eletrônica, o tecido pode ser usado para histologia, manchas imunológicas e hibridização in situ. Estes fornecerão mais informações sobre as mudanças celulares e moleculares durante a cicatrização da ferida. O uso de zebrafish amplia nosso conhecimento sobre biologia córnea.
Além disso, este modelo é excelente para estudos farmacológicos, e pode ser usado para entender mais sobre a evolução dos olhos.
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