Immunology and Infection
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एक सरल, लागत प्रभावी डीएनए अलगाव विधि का उपयोग करके ल्यूपस-प्रवण चूहों में फेकल माइक्रोबायोटा गतिशीलता का विश्लेषण
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यह प्रोटोकॉल ऑटोइम्यून बीमारी के विकास के दौरान मुराइन आंत माइक्रोबायोटा परिवर्तन के विश्लेषण के लिए एक सरल, लागत प्रभावी डीएनए अलगाव विधि प्रदान करता है।
Transcript
प्रस्तावित डीएनए अलगाव विधि ऑटोइम्यून रोगों माउस मॉडल में आंत माइक्रोबायोटा गतिशीलता का अध्ययन करने के लिए काम कर सकती है। फेकल नमूनों से डीएनए प्राप्त करने के लिए एक अधिक बहुमुखी, लागत प्रभावी और कुशल विधि प्रस्तावित है जो व्यावसायिक रूप से उपलब्ध किट के बराबर हैं। शुरू करने के लिए, प्रत्येक माउस को व्यक्तिगत रूप से अपने पिंजरे से बाहर निकालें, गुदा से सीधे एक फेकल गोली एकत्र करें और इसे संसाधित होने तक शून्य से 80 डिग्री सेल्सियस नीचे स्टोर करें।
बाँझ और साफ बल, ट्यूब और दस्ताने के साथ नमूने को संसाधित करें। एक पूर्व-वजन, दो मिलीलीटर स्क्रू कैप ट्यूब में एक जमे हुए गोली जोड़ें, और ग्राम में फेकल वजन रिकॉर्ड करें, जो 0.02 से 0.05 ग्राम प्रति फेकल गोली के बीच होना चाहिए। गोली में 0.1 मिलीमीटर ग्लास बीड्स की एक पतली परत, लाइसिस बफर के 500 माइक्रोलीटर और 20% सोडियम डोडेसिल सल्फेट के 200 माइक्रोलीटर जोड़ें।
बीड ने एक होमोजेनाइज़र में चार मिनट के लिए ट्यूब को हराया, इसके बाद तीन से पांच मिनट का भंवर। बुलबुले और फोम को खत्म करने के लिए ट्यूबों को थोड़े समय के लिए सेंट्रीफ्यूज करें। माइक्रोबायोटा के नमूनों से डीएनए निकालने के लिए, नमूना सतह पर तैरने वाले 350 माइक्रोलीटर को बिना किसी मलबे के एक नए, 1.5 मिलीलीटर स्नैप कैप ट्यूब में स्थानांतरित करें।
फिनोल: क्लोरोफॉर्म: आइसोमिल अल्कोहल के 500 माइक्रोलीटर जोड़ें, 25: 24: 1 के अनुपात में, और एक मिनट के लिए भंवर। सेंट्रीफ्यूजेशन के बाद, शीर्ष जलीय चरण के 180 माइक्रोलीटर को एक नए, 1.5 मिलीलीटर स्नैप कैप ट्यूब में स्थानांतरित करें। क्लोरोफॉर्म के 180 माइक्रोलीटर जोड़ें, इनवर्ट करें और मिलाएं।
इससे, जलीय चरण के 180 माइक्रोलीटर को एक नए स्नैप कैप ट्यूब में स्थानांतरित करें। एक जैव सुरक्षा कैबिनेट में, कोल्ड आइसोप्रोपेनॉल के 180 माइक्रोलीटर और पांच मोलर अमोनियम एसीटेट के 36 माइक्रोलीटर जोड़ें। मिश्रण करने के लिए इसे कुछ बार पलटें, और ट्यूब को 20 मिनट के लिए बर्फ पर रखें।
सतह पर तैरने वाले को त्याग दें, इसके बाद छर्रों को ठंडे 70% इथेनॉल के 500 माइक्रोलीटर के साथ कई बार धोएं। सतह पर तैरने वाला छोड़ दें, और ट्यूब को 20 मिनट के लिए टिशू पेपर पर उल्टा सुखाएं, जब तक कि गोली स्पष्ट न हो जाए। आणविक ग्रेड पानी के 50 माइक्रोलीटर में गोली को निलंबित करें, और बड़े डीएनए छर्रों को पूरी तरह से भंग करने के लिए 10 मिनट के लिए तरल को 37 डिग्री सेल्सियस पर गर्म करें।
गर्म करने के बाद, ढक्कन से संघनन बूंदों को पुनर्प्राप्त करने के लिए एक मिनट के लिए 3,400 गुना जी पर इन ट्यूबों को सेंट्रीफ्यूज करें। एकाग्रता को मापें, और स्पेक्ट्रोफोटोमीटर का उपयोग करके 260/280 अनुपात प्राप्त करें। अच्छी गुणवत्ता वाले डीएनए के लिए एक अनुपात आम तौर पर 1.8 और दो के बीच होता है।
तैयार नमूनों को कमरे के तापमान पर एक मिनट के लिए 600 गुना जी पर सेंट्रीफ्यूज करें, 24 घंटे के लिए शून्य से 80 डिग्री सेल्सियस नीचे ठंड से पहले। फिर, अनुक्रमण के लिए आर्गोन नेशनल लेबोरेटरी को एक से 50 नैनोग्राम प्रति माइक्रोलीटर तक की सांद्रता वाले नमूनों के 20 माइक्रोलीटर भेजें। रिसेप्टर सीएक्स 3सीआर 1 की कमी वाले माउस स्ट्रेन में जंगली प्रकार के एमआरएल / एलपीआर, एमआरएल / एलपीआर-सीएक्स 3 सीआर 1 जीएफपी / जीएफपी चूहों की तुलना में एक अलग आंत माइक्रोबायोटा संरचना होती है, जो संभावित रोगजनक बैक्टीरिया जैसे कि फाइलम प्रोटियोबैक्टीरिया के लिए प्रासंगिक है।
नमूने को दूषित करने से सावधान रहें। इसे बाँझ होने की जरूरत है। इसके अलावा, एक नई ट्यूब में सतह पर तैरने वाले को स्थानांतरित करते समय सटीकता के साथ पाइपिंग करना महत्वपूर्ण है।
यह विधि पीसीआर, प्रतिबंध एंजाइम पाचन, या जीनोमिक लाइब्रेरी निर्माण जैसे आणविक विश्लेषण के लिए उपयुक्त है। ल्यूपस में, हमने आंत माइक्रोबायोटा और ल्यूपस प्रगति के बीच एक मजबूत संबंध साबित किया।
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