Isolering af monocyt-makrofag-afstamningsceller fra rotteben ved sekundær adhærens metode

I denne protokol ekstraheres knoglemarv monocyt-makrofagceller ved sekundær adhærens metode. Knoglemarv monocyt-makrofagceller kan med succes differentiere sig til osteoklaster, hvilket giver en stabil cellemodel til undersøgelse af osteoklaster in vitro. Denne metode er velegnet til små knoglemarvsprøver og kan udtrække knoglemarv monocyt-makrofagceller fra knoglemarv enkelt og hurtigt uden at kræve højteknologisk laboratorieudstyr.

Stigningen af osteoklaster kan være den potentielle patogenese af osteoporose. Knoglemarv monocyt-makrofagceller har en vis forskningsværdi som osteoklastprecursorceller. Til at begynde med nedsænkes de aflivede rotter i 75% alkohol i 10 minutter til desinfektion.

Efter forsigtig fjernelse af alle rottens lemmer med saks og tang, aspireres med PBS ved hjælp af en pipette og skyller blodet, der klæber til lemmerne. Derefter ved to milliliter af 10% FBS DMEM i et fem milliliter rør. Efter overførsel af lemmerne i fem milliliterrøret skal du bruge en saks til at skære lemmerne i røret i små stykker og blande homogenatet for at genoplive knoglemarvscellerne i kulturmediet.

Stå i fem minutter, indtil vævsfragmenterne sætter sig til bunden af røret. Tilsæt derefter 10 ml 10% FBS DMEM i en 100 millimeter kulturskål, og overfør derefter supernatanten til kulturskålen. Inkuberes ved 37 grader Celsius i 5% kuldioxid i ca. 24 timer.

Efter denne inkubationstid vil størstedelen af mesenkymale stamceller klæbe til kulturskålvæggen og vokse langsomt, mens de fleste knoglemarvsmonocytonofagceller stadig vil blive suspenderet i kulturmediet. Overfør cellesuspensionen i 100 millimeter kulturskålen til en ny 25 centimeter firkantet kolbe og fortsæt med at dyrke cellerne ved 37 grader Celsius i 5% kuldioxid i yderligere 24 timer. Efter at have fjernet det gamle medium omhyggeligt, skal du udskifte med frisk medium, efter at knoglemarvsmonocyt-makrofagceller har klæbet til kolbevæggen.

Flowcytometri viste, at procentdelen af celler, der udtrykker CD11b og c, en molekylær markør på overfladen af monocyt-makrofag-afstamningsceller, var ca. 37,94%Med den kontinuerlige celleproliferation blev størstedelen af cellerne større inden for uregelmæssig form og voksede til en radial klæbende skive. TRAP-pletresultaterne viste, at sammenlignet med kontrolgruppen blev antallet af intracellulære lilla røde granulater signifikant forøget i celler induceret med receptoraktivator af nuklear faktor kappa B ligand og makrofagkolonistimulerende faktor. Western blot-analyse viste, at ekspressionsniveauerne af de osteoklastspecifikke proteiner TRAP og cathepsin K blev signifikant forøget i behandlede celler sammenlignet med kontrolgruppen.

Det vigtigste i denne procedure er tiden til at indsamle sekundære klæbende celler i 24 til 48 timers primær kultur, knoglemarv monocyt-makrofagceller begynder at klæbe fuldstændigt. Knoglemarv monocyt-makrofagceller isoleret ved denne metode kan induceres i osteoklaster in vitro, hvilket giver en stabil cellemodel til undersøgelse af osteoporose.