Isolering av monocytt-makrofag av slektslinjer fra rottebein ved sekundær tilslutningsmetode

I denne protokollen ekstraheres benmargsmonocytt-makrofagceller ved sekundær tilslutningsmetode. Benmarg monocytt-makrofagceller kan med hell skille seg ut i osteoklaster, noe som gir en stabil cellemodell for studiet av osteoklaster in vitro. Denne metoden er egnet for små benmargsprøver og kan trekke ut benmargsmonocytt-makrofagceller fra benmarg enkelt og raskt uten å kreve høyteknologisk laboratorieutstyr.

Økningen av osteoklaster kan være den potensielle patogenesen av osteoporose. Benmarg monocytt-makrofagceller har en viss forskningsverdi som osteoklastforløperceller. For å begynne med, senk de euthanized rotter i 75% alkohol i 10 minutter for desinfeksjon.

Etter forsiktig fjerning av alle lemmer av rotten med saks og tang, aspirerer med PBS ved hjelp av en pipette og skyller blodet som holder seg til lemmer. Deretter ved to milliliter av 10% FBS DMEM i en fem milliliter rør. Etter å ha overført lembenene inn i fem milliliterrøret, bruk saks til å kutte lembenene i røret i små biter og bland homogenatet for å gjenopplive benmargscellene i kulturmediet.

Stå i fem minutter til vevsfragmentene slo seg ned til bunnen av røret. Deretter legger du til 10 milliliter 10% FBS DMEM i en 100 millimeter kulturrett, og overfør deretter supernatanten til kulturretten. Inkuber ved 37 grader Celsius i 5% karbondioksid i ca. 24 timer.

Etter denne inkubasjonstiden vil flertallet av mesenchymale stamceller holde seg til kulturfatveggen og vokse sakte, mens de fleste benmargsmonocytt-makrofagceller fortsatt vil bli suspendert i kulturmediet. Overfør cellefjæringen i 100 millimeter kulturrett til en ny 25 centimeter firkantet kolbe og fortsett å dyrke cellene ved 37 grader Celsius i 5% karbondioksid i ytterligere 24 timer. Etter å ha fjernet det gamle mediet forsiktig, erstatt med friskt medium etter at benmarg monocytt-makrofagceller har festet seg til kolbeveggen.

Flowcytometri viste at prosentandelen celler som uttrykte CD11b og c, en molekylær markør på overflaten av monocytt-makrofagslinjeceller var ca. 37,94%Med den kontinuerlige celleproliferasjonen ble de fleste cellene større i uregelmessig form og vokste til en radial tilhengerskive. TRAP-flekkresultatene viste at sammenlignet med kontrollgruppen ble antallet intracellulære lilla røde granulater betydelig økt i celler indusert med reseptoraktivator av kjernefysisk faktor kappa B-ligand og makrofagkolonistimulerende faktor. Vestlig blotanalyse viste at uttrykksnivåene til osteoklastspesifikke proteiner TRAP og cathepsin K ble betydelig økt i behandlede celler sammenlignet med kontrollgruppen.

Det viktigste i denne prosedyren er tiden for å samle sekundære tilhengerceller i 24 til 48 timer med primærkultur, benmarg monocytt-makrofagceller begynner å holde seg helt. Benmarg monocytt-makrofagceller isolert ved denne metoden kan induseres til osteoklaster in vitro, noe som gir en stabil cellemodell for studiet av osteoporose.