Cancer Research
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Modèle expérimental d’immunothérapie du mélanome utilisant la vaccination tumorale avec une cytokine hématopoïétique
Chapters
Summary February 24th, 2023
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Le protocole présente un modèle d’immunothérapie du cancer utilisant la vaccination tumorale cellulaire avec le mélanome B16-F10 exprimant Flt3L. Ce protocole démontre les procédures, y compris la préparation de cellules tumorales en culture, l’implantation tumorale, l’irradiation cellulaire, la mesure de la croissance tumorale, l’isolement des cellules immunitaires intratumorales et l’analyse par cytométrie en flux.
Transcript
Ce protocole fournit un modèle clinique d’immunothérapie des tumeurs solides et une plateforme de recherche pour étudier la relation entre les cellules tumorales et les cellules immunitaires infiltrantes. Ce vaccin tumoral à base de cellules est pratique, simple à utiliser et peut être combiné avec d’autres modalités thérapeutiques telles que le blocage des points de contrôle, pour obtenir un effet additif ou synergique pouvant entraîner une immunité tumorale plus puissante et plus élevée. Ann Balancio, une technicienne de recherche de mon laboratoire, aidera à démontrer la procédure.
Pour commencer, culture de cellules de mélanome B16-F10 dans l’IMDM, contenant 10% de FBS inactif à la chaleur, 2 glutamine millimolaire, 1 pyruvate de sodium millimolaire, 1 millimolaire MEM acides aminés non essentiels et 100 unités par millilitre de pénicilline et de streptomycine. Maintenir la lignée cellulaire à 37 degrés Celsius avec 5% de dioxyde de carbone. Ensemencez et récoltez les cellules B16-F10 comme décrit dans le manuscrit textuel.
Retirez le milieu de culture et lavez les flacons une fois avec du PBS. Aspirer le PBS et ajouter 5 millilitres de trypsine-EDTA à 0,25%, puis tapoter sévèrement le bord du ballon de culture. Ajouter 15 millilitres de milieu de culture pour neutraliser la trypsine-EDTA et verser le contenu de la fiole dans un tube à centrifuger de 50 millilitres.
Lavez la surface de la vaisselle avec 10 millilitres de PBS et versez dans le même tube à centrifuger de 50 millilitres. Centrifuger les cellules pendant 5 minutes à 200 RCF. Jetez le surnageant et cassez la pastille de cellule en tapotant le fond du tube.
Ajouter froid 10 millilitres de PBS et pipeter doucement la suspension cellulaire. Ensuite, comptez manuellement les cellules à l’aide d’un hémocytomètre. Gardez les cellules sur la glace avant l’injection.
Implanter par voie intradermique 500 000 cellules tumorales B16-F10 dans 50 microlitres de PBS froid sur le flanc gauche, à l’aide d’une aiguille de calibre 30. La dose de cellules tumorales B16-F10 implantées peut devoir être ajustée dans une plage de 50 000 à 500 000 cellules pour un développement tumoral réussi. Après la mise en œuvre, mesurez la longueur et la largeur de la tumeur trois fois par semaine à l’aide d’un pied à coulisse numérique électronique.
Calculer le volume tumoral et traiter les souris avec un vaccin tumoral lorsque les tumeurs ont atteint une taille de deux millimètres comme décrit dans le manuscrit du texte. À l’aide d’un irradiateur à rayons X réglé à 160 kilovolts et 25 milliampères, irradier les cellules à 150 doses grises de rayons gamma. Compter et vérifier la viabilité cellulaire par coloration au bleu de trypan avant l’injection.
Injectez par voie intradermique aux souris 1 million de cellules B16-Flt3L irradiées dans 50 microlitres de PBS froid sur le même flanc que l’implantation tumorale d’origine. Environ un centimètre du site de la tumeur primaire aux jours 3, 6 et 9 après l’implantation cellulaire initiale. Marquez les sites d’injection de vaccin avec un stylo coloré pour les distinguer de la tumeur primaire.
Si 50 000 cellules B16-F10 ont été initialement implantées, il est recommandé d’effectuer un traitement vaccinal aux jours 8, 11 et 14. Chirurgicalement enlevé la tumeur avec la peau de chaque souris euthanasiée et la mettre dans une plaque de 24 puits avec 1 millilitre de milieu RPMI 1640 FBS 10%. Coupez les tumeurs en petits morceaux dans deux millilitres de tampon de digestion et incuber pendant 25 minutes à 37 degrés Celsius.
Ajouter 10 millilitres de milieu FBS RPMI 1640 à 10% pour arrêter la digestion. Transférer les cellules dans une crépine cellulaire de 40 micromètres à l’aide d’une pipette sérologique de 25 millilitres. Utilisez ensuite le piston d’une seringue d’un millilitre pour broyer les tissus.
Centrifuger les cellules à 500 RCF pendant 5 minutes à 4 degrés Celsius. Resuspendre la pastille dans 5 millilitres de milieu spécifique au gradient de densité à 40% dans du PBS dilué à une concentration de 1x. Ajouter lentement la suspension cellulaire sur 5 millilitres de milieu spécifique au gradient de densité à 80% contenant du PBS.
Centrifuger vers les cellules à 325 RCF avec un réglage de frein bas pendant 23 minutes à température ambiante. Après centrifugation, prélever soigneusement la couche de leucocytes à l’interface entre le milieu spécifique à gradient de densité de 40% et 80% et la faire passer à travers une crépine cellulaire de 40 micromètres. Centrifuger les cellules à 500 RCF pendant 5 minutes à 4 degrés Celsius.
Incuber la pastille dans deux millilitres de tampon de lyse des globules rouges pendant cinq minutes à température ambiante. Après l’incubation, ajouter 10 millilitres de milieu FBS RPMI 1640 à 10% pour éteindre le tampon de lyse des globules rouges. Centrifuger les cellules à 400 RCF pendant 5 minutes à 4 degrés Celsius.
Remettez les cellules en suspension dans 0,5 millilitre de milieu FBS RPMI 1640 à 10% et comptez le nombre total de cellules avant utilisation pour une analyse plus approfondie. Recueillir la rate ou les ganglions lymphatiques drainants comme témoins de la stratégie de déclenchement des sous-ensembles de cellules immunitaires par analyse par cytométrie de flux. Suivez la méthode d’isolement cellulaire décrite dans le manuscrit textuel.
Un point noir visible des cellules B16-F10 implantées était généralement observé à la surface de la peau environ trois jours après l’implantation de la tumeur. Les souris ont été traitées avec un vaccin tumoral trois, six et neuf jours après que le nodule tumoral ait atteint ou dépassé la taille de deux millimètres. Une réduction significative de la croissance tumorale a été observée dans le groupe de souris vaccinées environ deux semaines après l’implantation de la tumeur.
Les cellules recueillies dans la couche de leucocytes contenaient de nombreuses cellules tumorales, ce qui rendait difficile la définition facile de la population lymphocytaire. Par conséquent, les splénocytes ont été utilisés en parallèle, pour le contrôle approprié des sous-ensembles de cellules immunitaires intratumorales dans l’analyse de cytométrie de flux. Les stratégies de contrôle de CD103 positif, CD11C positif DC, CD8 positif, CD4 positif et Treg ont été tracées avec la matrice de compensation.
Des données représentatives des comptes acquis et de la fréquence de chaque population ont également été fournies. CD103 intratumoral positif, CD11C positif à CD11C de souris vaccinées, a montré une expression significativement élevée du ligand co-stimulant CD86. Les souris vaccinées ont également montré une augmentation des cellules CD8 positives et CD4 positives, Foxp3 négatives, ainsi que des CTL positifs pour la granzyme B positifs CD8 et positifs à l’interféron gamma.
Gardez une distance suffisante entre la tumeur primaire et le vaccin tumoral. Cette séparation physique est essentielle pour éviter une fusion potentielle entre les deux implants tumoraux.
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