Geautomatiseerde analyse van intracellulaire fenotypen van Salmonella met behulp van ImageJ

Deze fluorescentiemicroscopiemethode kwantificeert salmonellafenotypen in intestinale epitheelcellen op een geautomatiseerde manier, waardoor salmonella op grote aantallen stammen met schaalbare resolutie kan worden bestudeerd. Onze methode heeft het voordeel dat het tegelijkertijd kwantitatief, high-throughput en geautomatiseerd is, afhankelijk van zowel een gebieds- als een eencellige analyse. Het intracellulaire gedrag staat centraal in de gastheer-pathogeen interactie van veel bacteriën.

Onze methode kan eenvoudig worden aangepast aan andere bacteriële pathogenen dan salmonella, wat bijdraagt aan het begrip van hun pathogenese. Nadat u de afbeeldingen hebt verkregen, voert u een eencellige analyse uit door de acquisitie te openen. czi-bestand in ImageJ.

Splits de kanalen door op de afbeelding te klikken en Kleur te selecteren, gevolgd door Kanalen splitsen. Voor celsegmentatie kiest u de Z-vlakafbeelding in het titelvenster van de C1-acquisitie. Selecteer het titelvenster van de C1-acquisitie en klik op de afbeelding gevolgd door het duplicaat.

Schrijf vervolgens het nummer van het gekozen Z-vlak. Schrijf C1Zplane in het titelvak, schakel het selectievakje Stapel dupliceren uit en klik op OK om alleen de geselecteerde Z-vlakafbeelding te dupliceren. Er wordt een venster met de naam C1Zplane geopend met de geselecteerde Z-vliegtuigafbeelding.

Verbeter nu het beeldcontrast van de verkregen C1Zplane-afbeelding door Proces te selecteren en op Contrast verbeteren te klikken. Pas de verzadigde pixels aan, schakel Normaliseren in en klik op OK om de contrastverbeteringstechniek toe te passen om een contrastgenormaliseerde C1Zplane-afbeelding te verkrijgen. Ga naar het proces en klik op Maxima zoeken om de epitheelcellen te segmenteren in contrastgenormaliseerde C1Zplane-afbeelding.

Als u vervolgens slechts één maximumpunt aan elke epitheelcel wilt toewijzen, markeert u de selectie van het voorbeeldpunt en stelt u de ruistolerantie in. Als u de C1Zplane-gesegmenteerde afbeelding wilt verkrijgen, een nieuwe binaire maskerachtige afbeelding die elk gesegmenteerd deeltje per maximaal punt laat zien, markeert u de randmaxima uitsluiten, selecteert u de gesegmenteerde deeltjes als uitvoertype en klikt u op OK. Maak vervolgens een masker van gesegmenteerde cellen in de gesegmenteerde afbeelding van C1Zplane. Klik op Analyseren, gevolgd door Deeltjes analyseren en selecteer vervolgens de opties Maskers weergeven en Uitsluiten op randen.

Stel het grootte-interval in en klik op OK om het masker van het C1Zplane gesegmenteerde binaire masker te verkrijgen. Klik op de opzoektabel en selecteer Opzoektabel omkeren op de werkbalk. Als u de contrastgenormaliseerde C1Zplane-afbeelding wilt drempelen, gaat u naar de afbeelding, selecteert u Aanpassen, selecteert u Drempel en controleert u de donkere achtergrond.

Stel de instelling voor de automatische drempel in op standaard en kies de rode optie. Pas de minimale afkapwaarde aan totdat cellen volledig rood lijken, waardoor er een donkere achtergrond overblijft. Klik op Toepassen om de contrastgenormaliseerde C1Zplane-afbeelding om te zetten in een binaire afbeelding met cellen in wit en de achtergrond in zwart.

Verder, om de celsegmentatie in het masker van C1Zplane gesegmenteerd binair masker te corrigeren, selecteert u Proces en klikt u op de Image Calculator. Selecteer vervolgens het masker van C1Zplane gesegmenteerd als afbeelding één, kies de bewerking EN in de vervolgkeuzelijst en selecteer de genormaliseerde C1Zplane met drempel als afbeelding twee. Klik op OK en ImageJ geeft de uitvoerafbeelding automatisch een naam als resultaten van Masker van C1Zplane Gesegmenteerd.

Als u elke afzonderlijke gesegmenteerde cel van C1Zplane wilt labelen als een interessegebied, klikt u op Analyseren, gevolgd door Deeltjes analyseren. Pas de grootte aan zoals eerder gedemonstreerd en selecteer de optie Niets weergeven. Voeg alle deeltjes toe aan de ROI Manager-tool door Toevoegen aan manager aan te vinken.

Vink ook de optie Uitsluiten aan randen aan en klik op OK. Sla de ROI-gegevens op als roi-cells-acquisition-titel. blader door het menu ROI-beheer door op Meer te klikken en Opslaan te selecteren. Nadat u de celsegmentatie hebt voltooid, werkt u aan het C2-acquisitietitelvenster om vacuolaire salmonella te analyseren.

Ga eerst naar het proces, klik op de Afbeeldingscalculator, selecteer de C2-acquisitietitel als afbeeldingstitel en kies de bewerking Aftrekken in de vervolgkeuzelijst. Selecteer vervolgens de titel van de C3-acquisitie als afbeelding twee, vink Nieuw venster maken aan en klik op OK. Pas aftrekking toe op de hele Z-stapel door op Ja te klikken in het venster Processtack. Dupliceer de resultaten van het titelvenster van de C2-acquisitie door op het menu Afbeelding te klikken en Dupliceren te selecteren.

Controleer vervolgens de dubbele stapel en druk op OK om de resultaten van C2-acquisitietitel één venster te verkrijgen. Pas Gaussiaanse vervaging toe op de resultaten van C2-acquisitietitel één venster door naar het proces te gaan, op het filter te klikken en de Gaussiaanse vervaging te selecteren. Laat de Sigma-waarde als twee of pas deze aan.

Klik op OK en pas Gaussiaanse vervaging toe op de hele Z-stapel door op Ja te klikken in het venster Stapel verwerken. Trek de Gaussisch gefilterde resultaten van C2-acquisitietitel één af van de resultaten van de C2-acquisitietitel door op Proces te klikken en de Afbeeldingscalculator te selecteren. Selecteer nu de resultaten van de C2-acquisitietitel als afbeelding één, kies de bewerking Aftrekken in de vervolgkeuzelijst, selecteer de resultaten van C2-acquisitietitel één als afbeelding twee en klik op OK. Pas aftrekking toe op de hele Z-stapel door op Ja te klikken in het venster Processtack om een venster te verkrijgen dat automatisch door ImageJ wordt genoemd als het resultaat van de resultaten van de C2-acquisitietitel.

Als u salmonellae wilt scheiden van de achtergrond van de resultaten van de titel van de C2-acquisitie, klikt u op de afbeelding, selecteert u Aanpassen en klikt u op de drempelwaarde. Controleer vervolgens de donkere achtergrond en stel de automatische drempel in op Otsu. Pas de minimale afkapwaarde aan totdat salmonella’s volledig rood lijken, waardoor er een donkere achtergrond overblijft.

Klik op Toepassen en er wordt een venster met de naam Converteren naar binair geopend. Controleer de zwarte achtergrond en klik op OK. Selecteer het middelste Z-vlak dat overeenkomt met het intracellulaire salmonellae-focusvlak in de resultaten van het binaire venster C2-acquisitietitel. Klik op de afbeelding gevolgd door Stapels en selecteer vervolgens Segment instellen.

Schrijf nu het nummer van het Z-vlak van keuze en klik op OK. Stel vervolgens de metingen in om voor elke ROI te registreren door op Analyseren te klikken en Meting instellen te selecteren. Controleer vervolgens het gebied dat overeenkomt met het totale gebied van elke ROI. Als u de oppervlaktefractie wilt vastleggen die wordt ingenomen door drempelpixels voor elke ROI, controleert u de oppervlaktefractie en De drempel Beperken tot.

Controleer op het label Display om elke ROI te labelen met de afbeeldingstitel, het kanaal, het Z-vlak en de X/Y-coördinaten. Gebruik het gekozen Z-vlak van intracellulaire salmonellae om etiketten, oppervlakte en percentage gebied bezet door salmonellae voor elke afzonderlijke cel te registreren. Open de titel roi-cells-acquisition.

zip-bestand door op het menu Bestand te klikken en Openen te selecteren. Klik vervolgens op Meten in het menu ROI Manager. De uitvoer is een tabel die de geselecteerde metingen weergeeft.

Sla ten slotte de resultatentabel op door het bestand te selecteren en op Opslaan als te klikken in het resultatenvenster. De cellulaire invasie, de vacuolaire belasting en de cytosolische hyperreplicatie van salmonella werden gevisualiseerd in epitheelcellen. De gebiedsanalyse onthulde een significant hogere infectieratio in Salmonella typhimurium in vergelijking met beide Salmonella derby-stammen, wat de werkzaamheid van gebiedsanalyse aantoont bij het detecteren van verschillen in het vermogen van salmonellastammen om epitheelcellen te koloniseren.

Salmonella derby sipA-verwijderde mutante stam vertoonde een verminderde hyperreplicatieratio in vergelijking met Salmonella derby wild-type, consistent met de rol van sipA bij het induceren van hyperreplicatie. Er werd geen hyperreplicatieverschil waargenomen tussen Salmonella typhimurium en Salmonella derby wild-type. De eencellige analyse toonde geen significant verschil in het percentage geïnfecteerde cellen in Salmonella derby-stammen in vergelijking met Salmonella typhimurium.

Anders genereerden Salmonella derby-stammen een gemiddelde vacuolaire belasting die aanzienlijk lager was dan Salmonella typhimurium. Er werd geen verschil waargenomen tussen Salmonella typhimurium en Salmonella derby wild-type, terwijl Salmonella derby sipA een significante afname van hyperreplicatie vertoonde, in overeenstemming met het resultaat van de gebiedsanalyse. Salmonella omvat verschillende serovars met diverse virulentie.

Het onderzoeken van grote aantallen stammen met deze snelle en geautomatiseerde methode draagt aanzienlijk bij aan het begrijpen van het echte virulentiepotentieel van deze ziekteverwekker.