इमेजजे का उपयोग करके साल्मोनेला के इंट्रासेल्युलर फेनोटाइप का स्वचालित विश्लेषण

यह फ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोपी विधि आंतों के उपकला कोशिकाओं के अंदर साल्मोनेला फेनोटाइप को स्वचालित तरीके से निर्धारित करती है, जिससे स्केलेबल रिज़ॉल्यूशन के साथ बड़ी संख्या में उपभेदों पर साल्मोनेला का अध्ययन किया जा सकता है। हमारी विधि में एक ही समय में मात्रात्मक, उच्च-थ्रूपुट और स्वचालित होने का लाभ है, जो एक क्षेत्र और एकल-सेल विश्लेषण दोनों पर निर्भर करता है। इंट्रासेल्युलर व्यवहार कई बैक्टीरिया के मेजबान-रोगज़नक़ बातचीत के लिए केंद्रीय है।

हमारी विधि को साल्मोनेला के अलावा अन्य जीवाणु रोगजनकों के लिए आसानी से अनुकूलित किया जा सकता है, जो उनके रोगजनन की समझ में योगदान देता है। छवियों को प्राप्त करने के बाद, अधिग्रहण खोलकर एकल-सेल विश्लेषण करें। ImageJ में czi फ़ाइल.

छवि पर क्लिक करके और रंग का चयन करके चैनलों को विभाजित करें, इसके बाद स्प्लिट चैनल। सेल विभाजन के लिए, सी 1 अधिग्रहण शीर्षक विंडो में जेड विमान छवि चुनें। सी 1 अधिग्रहण शीर्षक विंडो का चयन करें और डुप्लिकेट के बाद छवि पर क्लिक करें।

फिर, चुने हुए Z विमान की संख्या लिखें। शीर्षक बॉक्स में C1ZPlan लिखें, डुप्लिकेट स्टैक को अनचेक करें, और केवल चयनित Z विमान छवि को डुप्लिकेट करने के लिए ठीक क्लिक करें। चयनित जेड विमान छवि दिखाने वाली सी 1 जेडप्लेन नामक एक विंडो खुल जाएगी।

अब प्रक्रिया का चयन करके और एन्हांस कंट्रास्ट पर क्लिक करके प्राप्त सी 1 जेडप्लेन छवि के छवि कंट्रास्ट को बढ़ाएं। संतृप्त पिक्सेल समायोजित करें, सामान्यीकृत जांचें, और कंट्रास्ट-सामान्यीकृत C1ZPlan छवि प्राप्त करने के लिए कंट्रास्ट एन्हांसमेंट तकनीक लागू करने के लिए ठीक क्लिक करें। प्रक्रिया पर जाएं और एपिथेलियल कोशिकाओं को कंट्रास्ट-सामान्यीकृत सी 1 जेडप्लेन छवि में विभाजित करने के लिए मैक्सिमा ढूंढें पर क्लिक करें।

फिर, प्रत्येक उपकला कोशिका को केवल एक मैक्सिमा बिंदु की विशेषता देने के लिए, पूर्वावलोकन बिंदु चयन को ध्वजांकित करें और शोर सहिष्णुता निर्धारित करें। C1ZPlane खंडित छवि प्राप्त करने के लिए, एक नई बाइनरी मास्क जैसी छवि जो प्रत्येक खंडित कण को प्रति मैक्सिमा बिंदु चिह्नित दिखाती है, किनारे मैक्सिमा को ध्वजांकित करती है, सेगमेंट किए गए कणों को आउटपुट प्रकार के रूप में चुनती है, और ठीक पर क्लिक करती है। इसके बाद, C1Zplane खंडित छवि में खंडित कोशिकाओं का एक मुखौटा बनाएं। विश्लेषण पर क्लिक करें, उसके बाद कणों का विश्लेषण करें, फिर विकल्पों का चयन करें मास्क दिखाएं और किनारों पर बाहर करें।

आकार अंतराल सेट करें और C1ZPlan सेगमेंटेड बाइनरी मास्क का मुखौटा प्राप्त करने के लिए ठीक पर क्लिक करें। लुकअप तालिका क्लिक करें और उपकरण पट्टी में इनवर्ट लुकअप तालिका का चयन करें। कंट्रास्ट-सामान्यीकृत C1ZPlane छवि को थ्रेशोल्ड करने के लिए, छवि पर जाएं, समायोजित करें, थ्रेशोल्ड का चयन करें, और अंधेरे पृष्ठभूमि की जांच करें।

डिफ़ॉल्ट रूप से ऑटो-थ्रेशोल्ड सेटिंग सेट करें और लाल विकल्प चुनें। न्यूनतम कटऑफ मान को समायोजित करें जब तक कि कोशिकाएं पूरी तरह से लाल दिखाई न दें, जिससे एक अंधेरी पृष्ठभूमि छोड़ दी जाए। कंट्रास्ट-सामान्यीकृत C1ZPlane छवि को सफेद और पृष्ठभूमि में काले रंग में कोशिकाओं के साथ द्विआधारी छवि में परिवर्तित करने के लिए लागू करें पर क्लिक करें।

इसके अलावा, सी 1 जेडप्लेन खंडित बाइनरी मास्क के मास्क में सेल विभाजन को सही करने के लिए, प्रक्रिया का चयन करें और छवि कैलकुलेटर पर क्लिक करें। फिर, छवि एक के रूप में खंडित C1ZPlane के मुखौटे का चयन करें, ऑपरेशन चुनें और ड्रॉपडाउन सूची में, और छवि दो के रूप में थ्रेशोल्ड कंट्रास्ट-सामान्यीकृत C1Zplan का चयन करें। ओके पर क्लिक करें और इमेजजे स्वचालित रूप से आउटपुट छवि को सी 1 जेडप्लेन सेगमेंटेड के मास्क के परिणामों के रूप में नाम देगा।

C1ZPlane के प्रत्येक खंडित सेल को रुचि के क्षेत्र के रूप में लेबल करने के लिए, विश्लेषण करें पर क्लिक करें, इसके बाद कणों का विश्लेषण करें। पहले दिखाए गए अनुसार आकार समायोजित करें और शो नथिंग विकल्प का चयन करें। प्रबंधक में जोड़ें की जाँच करके ROI प्रबंधक उपकरण में सभी कण जोड़ें।

इसके अलावा, किनारों पर बहिष्कृत की जांच करें और ओके पर क्लिक करें। ROI डेटा को roi-cells-अधिग्रहण शीर्षक के रूप में सहेजें। अधिक क्लिक करके और सहेजें का चयन करके ROI प्रबंधक मेनू के माध्यम से ज़िप करें। सेल विभाजन को खत्म करने के बाद, वैक्यूलर साल्मोनेला का विश्लेषण करने के लिए सी 2 अधिग्रहण शीर्षक विंडो पर काम करें।

सबसे पहले, प्रक्रिया पर जाएं, छवि कैलकुलेटर पर क्लिक करें, छवि एक के रूप में सी 2 अधिग्रहण शीर्षक का चयन करें, और ड्रॉपडाउन सूची में ऑपरेशन घटाएं चुनें। फिर, छवि दो के रूप में C3 अधिग्रहण शीर्षक का चयन करें, नई विंडो बनाएँ की जाँच करें, और ठीक क्लिक करें। प्रोसेस स्टैक विंडो में हाँ क्लिक करके पूरे जेड स्टैक पर घटाव लागू करें। छवि मेनू पर क्लिक करके और डुप्लिकेट का चयन करके सी 2 अधिग्रहण शीर्षक विंडो के परिणामों को डुप्लिकेट करें।

फिर डुप्लिकेट स्टैक की जांच करें और सी 2 अधिग्रहण शीर्षक एक विंडो के परिणाम प्राप्त करने के लिए ओके दबाएं। प्रक्रिया पर जाकर, फ़िल्टर पर क्लिक करके और गॉसियन ब्लर का चयन करके सी 2 अधिग्रहण शीर्षक एक विंडो के परिणामों पर गॉसियन ब्लर लागू करें। सिग्मा मान को दो के रूप में छोड़ दें या इसे अनुकूलित करें।

ओके पर क्लिक करें और प्रोसेस स्टैक विंडो में हां पर क्लिक करके पूरे जेड स्टैक पर गॉसियन ब्लर लागू करें। प्रक्रिया पर क्लिक करके और छवि कैलकुलेटर का चयन करके सी 2 अधिग्रहण शीर्षक के गॉसियन फ़िल्टर किए गए परिणामों को सी 2 अधिग्रहण शीर्षक के परिणामों में से एक घटाएं। अब छवि एक के रूप में सी 2 अधिग्रहण शीर्षक के परिणामों का चयन करें, ड्रॉपडाउन सूची में ऑपरेशन घटाएं, छवि दो के रूप में सी 2 अधिग्रहण शीर्षक एक के परिणामों का चयन करें, और ओके पर क्लिक करें। C2 अधिग्रहण शीर्षक के परिणामों के परिणामों के रूप में ImageJ द्वारा स्वचालित रूप से नामित विंडो प्राप्त करने के लिए प्रोसेस स्टैक विंडो में हाँ क्लिक करके पूरे Z स्टैक में घटाव लागू करें।

सी 2 अधिग्रहण शीर्षक के परिणामों के परिणामों की पृष्ठभूमि से साल्मोनेला को अलग करने के लिए, छवि पर क्लिक करें, समायोजित करें का चयन करें, और दहलीज पर क्लिक करें। फिर, अंधेरे पृष्ठभूमि की जांच करें और ऑटो-थ्रेशोल्ड को ओत्सु पर सेट करें। न्यूनतम कटऑफ मान को समायोजित करें जब तक कि साल्मोनेला पूरी तरह से लाल दिखाई न दे, जिससे एक अंधेरी पृष्ठभूमि न हो।

अप्लाई पर क्लिक करें और कन्वर्ट टू बाइनरी नाम की विंडो खुलेगी। काले पृष्ठभूमि की जाँच करें और ओके पर क्लिक करें। सी 2 अधिग्रहण शीर्षक बाइनरी विंडो के परिणामों के परिणामों में इंट्रासेल्युलर साल्मोनेला फोकस प्लेन के अनुरूप मध्य जेड विमान का चयन करें। स्टैक्स के बाद छवि पर क्लिक करें और फिर स्लाइस सेट करें का चयन करें।

अब पसंद के Z विमान की संख्या लिखें और OK पर क्लिक करें। इसके बाद, विश्लेषण क्लिक करके और सेट माप का चयन करके प्रत्येक आरओआई के लिए रिकॉर्ड करने के लिए माप सेट करें। फिर, प्रत्येक आरओआई के कुल क्षेत्र के अनुरूप क्षेत्र की जांच करें। प्रत्येक आरओआई के लिए थ्रेशोल्ड पिक्सेल द्वारा कब्जा किए गए क्षेत्र अंश को रिकॉर्ड करने के लिए, क्षेत्र अंश और सीमा से सीमा की जांच करें।

छवि शीर्षक, चैनल, जेड विमान और एक्स / वाई निर्देशांक के साथ हर एक ROI को लेबल करने के लिए डिस्प्ले लेबल पर जांचें। प्रत्येक सेल के लिए साल्मोनेला द्वारा कब्जा किए गए लेबल, क्षेत्र और प्रतिशत क्षेत्र को रिकॉर्ड करने के लिए इंट्रासेल्युलर साल्मोनेला के चुने हुए जेड विमान का उपयोग करें। Roi-cells-अधिग्रहण शीर्षक खोलें।

फ़ाइल मेनू पर क्लिक करके और खोलें का चयन करके फ़ाइल ज़िप करें। फिर, ROI प्रबंधक मेनू में माप पर क्लिक करें। आउटपुट चयनित मापों की रिपोर्ट करने वाली एक तालिका है।

अंत में, फ़ाइल का चयन करके और परिणाम विंडो में इस रूप में सहेजें पर क्लिक करके परिणाम तालिका सहेजें। सेलुलर आक्रमण, वैक्यूलर लोड, और साल्मोनेला के साइटोसोलिक हाइपर-प्रतिकृति को उपकला कोशिकाओं के अंदर देखा गया था। क्षेत्र विश्लेषण ने दोनों साल्मोनेला डर्बी उपभेदों की तुलना में साल्मोनेला टाइफीम्यूरियम में काफी अधिक संक्रमण अनुपात का खुलासा किया, जो उपकला कोशिकाओं को उपनिवेश ति करने के लिए साल्मोनेला उपभेदों की क्षमता में अंतर का पता लगाने में क्षेत्र विश्लेषण की प्रभावकारिता का प्रदर्शन करता है।

साल्मोनेला डर्बी एसआईपीए-हटाए गए उत्परिवर्ती तनाव ने साल्मोनेला डर्बी वाइल्ड-टाइप की तुलना में कम हाइपर-प्रतिकृति अनुपात प्रदर्शित किया, जो हाइपर-प्रतिकृति को प्रेरित करने में एसआईपीए की भूमिका के अनुरूप है। साल्मोनेला टाइफीम्यूरियम और साल्मोनेला डर्बी वाइल्ड-टाइप के बीच कोई हाइपर-प्रतिकृति अंतर नहीं देखा गया। एकल-कोशिका विश्लेषण ने साल्मोनेला टाइफीम्यूरियम की तुलना में साल्मोनेला डर्बी उपभेदों में संक्रमित कोशिकाओं के प्रतिशत में कोई महत्वपूर्ण अंतर नहीं दिखाया।

अन्यथा, साल्मोनेला डर्बी उपभेदों ने साल्मोनेला टाइफीम्यूरियम की तुलना में काफी कम औसत वैक्यूलर लोड उत्पन्न किया। साल्मोनेला टाइफीम्यूरियम और साल्मोनेला डर्बी वाइल्ड-टाइप के बीच कोई अंतर नहीं देखा गया, जबकि साल्मोनेला डर्बी एसआईपीए ने क्षेत्र विश्लेषण के परिणाम के अनुरूप हाइपर-प्रतिकृति में महत्वपूर्ण कमी प्रदर्शित की। साल्मोनेला में विविध विषाणु वाले कई सेरोवर शामिल हैं।

इस तेज और स्वचालित विधि द्वारा बड़ी संख्या में उपभेदों की जांच करना इस रोगज़नक़ की वास्तविक विषाणु क्षमता को समझने में महत्वपूर्ण योगदान देता है।