Bioengineering
This content is Free Access.
The JoVE video player is compatible with HTML5 and Adobe Flash. Older browsers that do not support HTML5 and the H.264 video codec will still use a Flash-based video player. We recommend downloading the newest version of Flash here, but we support all versions 10 and above.
If that doesn't help, please let us know.
In vitro Splitsingstests met gezuiverde recombinante Drosophila Caspases voor substraatscreening
Chapters
Summary October 6th, 2022
Please note that all translations are automatically generated.
Click here for the English version.
Hier presenteren we een protocol om recombinant Drosophila caspases Dronc en Drice uit te drukken en te zuiveren, en hun gebruik in in vitro splitsingstests.
Transcript
Caspasen zijn cysteïneproteasen die substraten splitsen tijdens apoptose en niet-apoptotische processen. Dit protocol beschrijft een in vitro splitsingstest om vermeende substraten van de initiator caspase Dronc uit Drosophila te identificeren. Indien zorgvuldig gevolgd, biedt dit protocol een betrouwbare procedure voor high throughput screening van vermeende substraten van de caspase Dronc, of een andere caspase.
Hoewel dit protocol is ontworpen voor in vitro splitsingstests met behulp van de Drosophila caspase Dronc, kan het gemakkelijk worden aangepast voor caspasen van andere organismen, waaronder zoogdieren. Het is belangrijk dat de zuivering van de recombinante caspasen en de in vitro splitsingstests op dezelfde dag worden uitgevoerd, omdat deze caspasepreparaten snel enzymatische activiteit verliezen. Dr. Prathibha Yarikipati, een postdoctorale fellow van mijn laboratorium, demonstreert de procedure.
Verwijder om te beginnen de bevroren buizen met de gepelletiseerde culturen uit min 80 graden Celsius opslag en bewaar ze 10 minuten op ijs om de pellet zacht te maken. Voeg na 10 minuten 0,6 milliliter bacteriële cellysebuffer aangevuld met vers toegevoegde proteaseremmers, 10 milligram per milliliter lysozym en 50 eenheden per milliliter benzonase toe aan de pelletbevattende buizen met behulp van een pipetcontroller met een serologische pipet van één milliliter. Los met dezelfde pipetpunt de pellet op door op en neer te pipetteren totdat een heldere, lichtgele oplossing, zonder pelletdeeltjes, zichtbaar is en gedurende 30 minuten op ijs incubeer.
Breng lysaten over in geschikte centrifugebuizen en centrifugeer ze bij 17.000 G gedurende 40 minuten bij 4 graden Celsius. Breng de supernatanten over in een microcentrifugebuis van 1,5 milliliter, het ruwe extract dat de caspasen bevat, en houd de buizen op ijs. Voeg 0,2 milliliter van de 50% slurry ni-salpetloazijnzuur agarose toe aan elke buis van de caspase-extracten en draai de buizen gedurende een uur op een end-on-end rotator bij 4 graden Celsius.
Voeg na een uur het extract met de Ni-nitriloacetic acid agarose toe aan één milliliter polypropyleenkolommen met een punt intact, geplaatst in een rek, en laat het vijf minuten staan om Ni-salpetlo-agaasezuur te laten bezinken. Verwijder na vijf minuten de dop van de kolommen en laat het supernatant door de zwaartekracht naar buiten stromen. Voeg vervolgens voorzichtig een milliliter van de wasbuffer toe aan de kolommen zonder de verpakte hars van Ni-salpeterezijnzuur agarose te verstoren en was deze door de zwaartekrachtstroom.
Plaats voor de elutie van de caspasen 1,5 milliliter microcentrifugebuizen onder het opvangmondstuk van de kolommen, na volledige afvoer van de wasbuffer. Voeg vervolgens 0,5 milliliter van de elutiebuffer toe aan elke kolom en verzamel de eluant in de microcentrifugebuizen van 1,5 milliliter. Houd de eluants op ijs en meet de concentratie van eiwitten door Bradford assay.
Afhankelijk van het expressieniveau van het vermeende substraat, gebruikt u 1 tot 10 microliter van het konijnenreticulocytenlysaat geprogrammeerd met het eiwit van belang in de splitsingstest en houdt u het op ijs. Voeg 10 microgram eerder gegenereerd gezuiverd caspase-eiwit toe en breng het totale reactievolume op 50 microliter met caspase-testbuffer. Incubeer de reacties in een waterbad bij 30 graden Celsius gedurende drie uur en zorg ervoor dat de juiste controles in de splitsingstest worden opgenomen.
Stop na drie uur de reacties door de buizen op ijs over te brengen en voeg één volume LDS-monsterbuffer toe met 50 millimol DTT. Incubeer de monsters bij 75 graden Celsius in een hitteblok gedurende 10 minuten. Draai snel, meng door te vegen, laad 24 microliter per monster en voer de SDS-pagina uit of bewaar de monsters bij min 20 graden Celsius.
Vier verschillende recombinante caspasen werden geïnduceerd, gezuiverd en geanalyseerd door SDS-PAGE, immunoblotted, en de vlek werd onderzocht met een antihistidine-antilichaam. De onbewerkte 6x-Histidine Dronc heeft een relatief molecuulgewicht van 55 kilodalton en de onbewerkte 6x-His DRICE heeft een molecuulgewicht van 35 kilodalton. Automatische verwerking van de caspasen is zichtbaar door het verschijnen van banden met een kleiner molecuulgewicht.
Voor gespleten Dronc is het een band van 40 kilodalton. Voor gespleten Drice is het een band van 23 kilodalton. Na de in vitro splitsingsreactie werden de eiwitten gescheiden door SDS-PAGE, immunoblotted, en de vlekken werden geïncubeerd met een anti-Myc-antilichaam om aminoterminaal Myc-gelabelde Drice C211A te detecteren.
De resultaten toonden aan dat het bacterieel geproduceerde en gezuiverde 6x-histidine Dronc wild-type preparaat enzymatische activiteit heeft. Dit is zichtbaar aan de aanwezigheid van de kleinere band van gespleten Drice in vergelijking met ongemeten proDrice. De in vitro splitsingsreactie die zowel recombinant caspase als substraat gebruikt, werd geanalyseerd door SDS-PAGE en immunoblot.
Voor de analyse van de splitsingsreactie werd in dit immunoblot het anti-gesplitste Drice-antilichaam gebruikt. De resultaten toonden aan dat het bacterieel geproduceerde en gezuiverde 6x-His Dronc-preparaat enzymatische activiteit heeft. Dit is zichtbaar aan de aanwezigheid van de kleinere band van gekloofde Drice in vergelijking met de ongemeten proDrice.
Houd er rekening mee dat recombinante caspasen snel enzymatische activiteit verliezen. Ze kunnen niet worden bewaard, zelfs niet bij min 80 graden Celsius. De in vitro splitsingstests moeten op dezelfde dag worden uitgevoerd.
Positieve treffers in de in vitro splitsingstest moeten in vivo worden gevalideerd. Dit kan worden gedaan in cellen of in genetische modelorganismen zoals Drosophila of C.elegans.
Related Videos
You might already have access to this content!
Please enter your Institution or Company email below to check.
has access to
Please create a free JoVE account to get access
Login to access JoVE
Please login to your JoVE account to get access
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Please enter your email address so we may send you a link to reset your password.
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Your JoVE Unlimited Free Trial
Fill the form to request your free trial.
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Thank You!
A JoVE representative will be in touch with you shortly.
Thank You!
You have already requested a trial and a JoVE representative will be in touch with you shortly. If you need immediate assistance, please email us at subscriptions@jove.com.
Thank You!
Please enjoy a free 2-hour trial. In order to begin, please login.
Thank You!
You have unlocked a 2-hour free trial now. All JoVE videos and articles can be accessed for free.
To get started, a verification email has been sent to email@institution.com. Please follow the link in the email to activate your free trial account. If you do not see the message in your inbox, please check your "Spam" folder.
