沿岸海水サンプルの大容量(20L +)ろ過

Biology

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Summary

このビデオ、ドキュメント、大容量(≥20リットル)の水のカラムから、直径0.22μmと2.7μmの範囲の微生物バイオマスのろ過、、。

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Walsh, D. A., Zaikova, E., Hallam, S. J. Large Volume (20L+) Filtration of Coastal Seawater Samples. J. Vis. Exp. (28), e1161, doi:10.3791/1161 (2009).

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Abstract

ワークフローは、下流の微生物群集のための沿岸海域、栄養素と微量ガス分析の収集から始まります。この方法の場合、サンプルはサーニッチのインレットでHMSジョンストリックランドの動作のデッキから採取された。このビデオ、ドキュメント、大容量(≥20リットル)の水のカラムから、直径0.22μmと2.7μmの範囲の微生物バイオマスのろ過、、。二つの20Lのサンプルは、4つの回転ヘッドを搭載した単一のポンプユニットを使用して同時にフィルタリングすることができます。ろ過は、拡張出張、または直後の日帰り旅行の戻り時にフィールドで行われます。各sterivexフィルタユニットを通過する水の量を記録することが重要です。サンプリングの合間にバイオフィルム形成を防止するために、すべてのろ過装置を希HCl及び脱イオン水で洗浄し、使用後すぐにオートクレーブする必要があります。この手順では、約5時間に加えて、クリーンアップのための追加時間がかかります。

Protocol

  1. ろ過装置のセットアップ。
    1. ろ過装置を設定するには、プレフィルターハウジングユニットにグレードGF / Dフィルタを配置するピンセットを使用してください。緩く手で住宅を締めます。経験則として、締めすぎないでくださいまたはユニットには、ポンピング開始されるとリークが発生します。
    2. 慎重にそれに触れることなくカーボイ​​に内部チューブを挿入することにより、オートクレーブキャップと付属のチューブでカーボイキャップを交換してください。必要に応じて、カーボイにチューブを導くためにピンセットを使用してください。
    3. 蠕動ポンプを介して外部配管を渡す。
    4. 外部チューブ(カーボイあたりすなわち2台)の両方の端にプレフィルターハウジングユニットを取り付けます。プライヤーとの接続を締めます。
  2. 海水のろ過
    1. 海水のフィルタリングを開始するために、ポンプをオンにし、1にフローの速度を設定します。その水が適切な方向に励起されるように監視します。
    2. 水500mlは、プレフィルターユニットを介して、1 Lビーカーに自由に流れるようになります。
    3. ポンプの電源をオフにし、プレフィルターの設定の自由端にオスルアーフィッティングにSterivexフィルタを取り付けます。手でしっかりプレフィルターハウジングを締めます。
    4. プレフィルターハウジングでとプレフィルターハウジングとカーボイにつながるチューブの間の接続で待ってください。リークが発生した場合は、ポンプの電源をオフにし、それに応じてプレフィルターハウジングを緩め、締め。背面にポンプの電源を入れます。
    5. 4 Lのフラスコにろ液を集める。いったんはきれいカーボイにフラスコは、空いっぱいです。各フィルターを通過量をメモしておいてください。収集された濾液は、ウイルスのためのろ過など、さらに処理することができます。
    6. ない水がその他これらに残っていないまでフィルタリングを続けます。 4〜5時間/ 20 Lのカーボイの間に通常の濾過時間の範囲は、しかし、これは水の中のバイオマス量を飛躍的に依存する。
    7. ろ過が完了したら、ポンプの電源を切り、Sterivexフィルターを外してください。
  3. フィルターの保管
    1. フィルタを保存するには、まず、30〜60ミリリットルの注射器と、残りの水を排出する。
    2. ピペットを用いて、試薬の後に追加するためのフィルタでスペースの〜200μlの維持、フィルターに1.8ミリリットルの溶解バッファーを追加します。
    3. パラフィルムの小片でSterivexフィルターの底部と上部をシールし、日付とサンプルの識別とフィルタラベルを付けます。
    4. -80あらかじめ標識した50mlファルコンチューブにフィルターを保管° C
    5. 住宅ユニットからフィルターを外し、溶解用緩衝液2 mlを含むラベルが付いた50mlファルコンチューブに入れます。 -80これら℃にて保存してくださいを
  4. クリーン
    1. 最終的なクリーンアップのために、0.1 M HClを含むフラスコにカーボイの中にあったチュ​​ーブを配置
    2. オリジナルカーボイに4Lフラスコにつながるチューブを指示。
    3. ポンプのスイッチを入れると、元カーボイで実行フロースルーを収集し、3で実行する。
    4. 最後に、オートクレーブ水でチューブをリンス。

代表的な結果:最終的な結果が2 Sterivixフィルター0.22μmと2.7μmの大きさの範囲で約10リットルの海水から微生物バイオマスを含む各で構成されています。これは、溶解バッファーに格納され、DNAの抽出のための準備ができています。さらに、この手順では、収集し、GF / Dプレフィルタで、2.7μmを超えるバイオマスを集中する。これはまた、溶解バッファーに格納され、DNAの抽出のための準備ができています。追加の処理ステップがとられるならば、フロースルー0.22μmのは、同様にウイルスの割合を収集するためにダウン濃縮することができる。

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Discussion

それ以外の機器を腐食させるという塩水のいずれか残る痕跡を除去するために使用後の湿ったタオルでベンチやポンプを拭うために不可欠です。手順はシンプルですが、時間の要件は、フィルタリングされているサンプルのバイオマスや破片の濃度に応じて豊富なことができます。

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Acknowledgments

我々は、沿岸と外洋水の低酸素領域で進行中の研究を支援するためのイノベーション、ブリティッシュコロンビア州の知識開発基金と国立科学およびカナダの工学研究審議会(NSERC)のためのカナダの財団に感謝の意を表します。 DAWはNSERC、キラムとトゥーラ基礎微生物の多様性と進化のための資金を供給センターからの奨学金によって支えられている。

Materials

Name Type Company Catalog Number Comments
Peristaltic pump Masterflex (Cole Palmer) 77913-20, 77200-62, 77200-04
Tygon LFL tubing Masterflex (Cole Palmer) 06429-24 For filtration apparatus
Hose clamps Cole-Parmer 0683204 For filtration apparatus
1/4” x 3/16” pipe adaptors Cole-Parmer 31702-20 For filtration apparatus
Polypropylene prefilter housing ADVANTEC 501200 For filtration apparatus
Metal luer fitting (Hose end to Male luer lock) Cole-Parmer 31507-27 For filtration apparatus
2“ Magnets For filtration apparatus
3 port carboy caps For filtration apparatus
GV 0.22 μm STERIVIX filters EMD Millipore SVGV01R5
47 mm diameter 2.7 μm GF/D filters Whatman, GE Healthcare 1823047
Lysis buffer Reagent 0.75 M sucrose, 40 mM EDTA, 50 mM Tris (pH 8.3)
0.1 % HCl Reagent For post-filtration rinse
Autoclaved water Reagent For post-filtration rinse

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Comments

4 Comments

  1. Cool way to show off filtration protocols! Do your pre-filters ever clog?

    Reply
    Posted by: Anonymous
    June 19, 2009 - 12:56 AM
  2. Hi Ian, We never have problems with pre-filter clogs but if microbial biomass is high, we do need to switch up the filters often.

    Reply
    Posted by: Anonymous
    June 19, 2009 - 2:39 PM
  3. How much dŒs the filtration apparatus cost?

    Reply
    Posted by: Anonymous
    July 1, 2009 - 4:46 AM
  4. For you is for free

    Reply
    Posted by: Anonymous
    December 18, 2011 - 4:45 PM

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