Volume grande (20L +) Filtração das amostras Seawater Coastal

Biology

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Summary

Este vídeo volume de documentos grandes (≥ L 20) de filtragem da biomassa microbiana, variando entre 0.22μm e 2.7μm de diâmetro, a partir da coluna de água.

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Walsh, D. A., Zaikova, E., Hallam, S. J. Large Volume (20L+) Filtration of Coastal Seawater Samples. J. Vis. Exp. (28), e1161, doi:10.3791/1161 (2009).

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Abstract

O fluxo de trabalho começa com a recolha de águas marinhas costeiras para a comunidade microbiana a jusante, as análises de nutrientes e gases traço. Para este método, as amostras foram coletadas a partir do convés do HMS operacional John Strickland em Inlet Saanich. Este vídeo volume de documentos grandes (≥ L 20) de filtragem da biomassa microbiana, variando entre 0.22μm e 2.7μm de diâmetro, a partir da coluna de água. Duas amostras de 20L podem ser filtrados simultaneamente usando uma unidade de bomba simples equipados com quatro cabeças rotativas. Filtração é feito no campo em viagens longas, ou imediatamente após o retorno para viagens curtas. É importante registrar a quantidade de água que passa através de cada unidade de filtro sterivex. Para evitar a formação de biofilme entre viagens de amostragem, todos os equipamentos de filtração deve ser lavado com HCl diluído e água deionizada e autoclavada imediatamente após o uso. Este procedimento levará aproximadamente cinco horas, mais uma hora adicional para a limpeza.

Protocol

  1. Instalação de aparelho de filtração
    1. Para configurar o aparelho de filtração, use uma pinça para colocar uma grade GF / D filtro na unidade de habitação pré-filtro. Vagamente apertar a habitação com a mão. Como regra geral, não aperte demais ou a unidade vai vazar uma vez que o começa a pulsar.
    2. Recoloque a tampa garrafão com a tampa autoclavada e tubos ligados com cuidado de inserir o tubo interno para o garrafão sem tocá-lo. Se necessário, use uma pinça para guiar o tubo no garrafão.
    3. Passe a tubulação externa através da bomba peristáltica.
    4. Anexar unidades habitacionais pré-filtro para o fim de ambos os tubos externos (ou seja, 2 unidades por garrafão). Aperte a conexão com um alicate.
  2. Filtração da água do mar
    1. Para começar a filtrar a água do mar, ligue a bomba e definir a velocidade de fluxo para 1. Relógio para garantir que a água está sendo bombeado na direção correta.
    2. Permitir que 500 ml de água para fluir livremente através da unidade de pré-filtro e em um copo de 1 litro.
    3. Desligar a bomba, e anexar um filtro Sterivex ao encaixe macho luer na extremidade livre de configuração pré-filtro. Aperte o confortavelmente de habitação pré-filtro com a mão.
    4. Preste atenção para a habitação pré-filtro e na ligação entre a caixa pré-filtro ea tubulação que leva ao garrafão. Se ocorrer vazamentos, desligar a bomba e soltar e apertar novamente o pré-filtro de habitação em conformidade. Ligar a bomba novamente.
    5. Recolher o filtrado em 4 frascos L. Uma vez cheios, os frascos vazios em um garrafão limpo. Certifique-se de anotar o volume passou por cada filtro. Coletados filtrado pode ser processado, como filtragem de vírus.
    6. Continue até que não haja filtragem da água é deixada no garrafões. Usuais de filtração gama vezes entre 4-5 h / 20 carboy L, no entanto, isso depende de forma dramática na quantidade de biomassa dentro da água.
    7. Uma vez que a filtração é completa, ligue a bomba e desconecte os filtros Sterivex.
  3. Armazenamento do filtro
    1. Para armazenar os filtros, primeiro expulsar qualquer água restante com uma seringa ml 30-60.
    2. Com uma pipeta, adicionar tampão de lise 1.8ml para o filtro, mantendo ~ ul 200 de espaço no filtro para adição posterior de reagentes.
    3. Seal parte inferior e superior do filtro Sterivex com um pequeno pedaço de parafilme, e rotular os filtros com a data ea identificação da amostra.
    4. Armazenar os filtros em 50 ml de pré-rotulados tubo falcon a -80 ° C
    5. Remover os filtros da unidade habitacional e colocá-los em tubos de 50 ml rotulados Falcon contendo 2 ml de tampão de lise. Armazenar estes a -80 ° C.
  4. Limpeza
    1. Para limpeza final, coloque o tubo que estava dentro do garrafão em um frasco contendo 0,1 M HCl
    2. Direcionar o tubo que levam ao balão 4L no garrafão original.
    3. Ligue a bomba e executar a 3, coletando o fluxo através executado no garrafão original.
    4. Finalmente, lavar o tubo com água esterilizada.

Resultados Representante: O resultado final consiste em dois filtros Sterivix cada um contendo biomassa microbiana de aproximadamente 10 L de água do mar na faixa de tamanho de 0.22μm e 2.7μm. Este é armazenado em tampão de lise e pronto para a extração de DNA. Além disso, este procedimento recolhe e concentra biomassa maior do que 2,7 mM, sobre o pré-filtros GF / D. Este também é armazenado em tampão de lise e pronto para a extração de DNA. Se as etapas de processamento adicional são tomadas, a 0,22 mM de fluxo pode ser concentrada até recolher a fração viral também.

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Discussion

É imperativo para limpar os bancos e as bombas com uma toalha úmida após o uso para remover qualquer vestígio remanescente de água salgada que de outra forma corroer equipamentos. Embora o procedimento é simples, o requisito de tempo pode ser extensa, dependendo da concentração de biomassa ou resíduos na amostra que está sendo filtrado.

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Acknowledgments

Gostaríamos de agradecer à Fundação Canadense para Inovação, a British Columbia Fundo de Desenvolvimento do Conhecimento e das Ciências e Pesquisa de Engenharia National Council (NSERC) do Canadá para apoiar estudos em andamento em regiões de baixo oxigênio das águas oceânicas costeiras e aberto. DAW foi apoiado por bolsas de NSERC, Killam ea fundação TULA Centro financiado pela Diversidade Microbiana e Evolution.

Materials

Name Type Company Catalog Number Comments
Peristaltic pump Masterflex (Cole Palmer) 77913-20, 77200-62, 77200-04
Tygon LFL tubing Masterflex (Cole Palmer) 06429-24 For filtration apparatus
Hose clamps Cole-Parmer 0683204 For filtration apparatus
1/4” x 3/16” pipe adaptors Cole-Parmer 31702-20 For filtration apparatus
Polypropylene prefilter housing ADVANTEC 501200 For filtration apparatus
Metal luer fitting (Hose end to Male luer lock) Cole-Parmer 31507-27 For filtration apparatus
2“ Magnets For filtration apparatus
3 port carboy caps For filtration apparatus
GV 0.22 μm STERIVIX filters EMD Millipore SVGV01R5
47 mm diameter 2.7 μm GF/D filters Whatman, GE Healthcare 1823047
Lysis buffer Reagent 0.75 M sucrose, 40 mM EDTA, 50 mM Tris (pH 8.3)
0.1 % HCl Reagent For post-filtration rinse
Autoclaved water Reagent For post-filtration rinse

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Comments

4 Comments

  1. Cool way to show off filtration protocols! Do your pre-filters ever clog?

    Reply
    Posted by: Anonymous
    June 19, 2009 - 12:56 AM
  2. Hi Ian, We never have problems with pre-filter clogs but if microbial biomass is high, we do need to switch up the filters often.

    Reply
    Posted by: Anonymous
    June 19, 2009 - 2:39 PM
  3. How much dŒs the filtration apparatus cost?

    Reply
    Posted by: Anonymous
    July 1, 2009 - 4:46 AM
  4. For you is for free

    Reply
    Posted by: Anonymous
    December 18, 2011 - 4:45 PM

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