एफएम लेबल का प्रयोग न्यूरॉन्स में exocytosis माप

Biology

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Summary

पुटिका रिलीज के कैनेटीक्स को मापने की क्षमता neurotransmission की मूल बातें की कुछ अंतर्दृष्टि प्रदान में मदद कर सकते हैं. यहाँ हम लाल फ्लोरोसेंट डाई 4-64 एफएम के साथ लेबल hippocampal neuronal संस्कृतियों में presynaptic पुटिका रिहाई की दर को मापने के vesicles की वास्तविक समय इमेजिंग इस्तेमाल किया.

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Newton, J., Murthy, V. Measuring Exocytosis in Neurons Using FM Labeling. J. Vis. Exp. (1), e117, doi:10.3791/117 (2006).

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Abstract

पुटिका रिलीज के कैनेटीक्स को मापने की क्षमता neurotransmission की मूल बातें की कुछ अंतर्दृष्टि प्रदान में मदद कर सकते हैं. यहाँ हम एफएम डाई के साथ लेबल presynaptic पुटिका रिहाई की दर पर नजर रखने के vesicles की वास्तविक समय इमेजिंग इस्तेमाल किया. FM4-64 एक लाल फ्लोरोसेंट amphiphilic styryl डाई है कि synaptic vesicles की झिल्ली में embeds endocytosis के रूप में प्रेरित है. Lipophilic बातचीत डाई बहुत प्रतिदीप्ति में वृद्धि करने के लिए, इस प्रकार एक उज्ज्वल संकेत उत्सर्जन जब vesicles और एक नाममात्र कोशिकी द्रव में जब के साथ जुड़े कारण हैं. एक धोने के बाद कदम के प्लाज्मा झिल्ली के भीतर बाहरी डाई हटाने में मदद करने के लिए प्रयोग किया जाता है, शेष एफएम vesicles के भीतर केंद्रित है और फिर से निष्कासित कर दिया, जब exocytosis बिजली की उत्तेजना के दूसरे दौर से प्रेरित है. vesicles के रिलीज की दर प्रतिदीप्ति जिसके परिणामस्वरूप में कमी से मापा जाता है. चूंकि एफएम डाई बाह्य लागू किया जा सकता है और transiently, यह neuronal संस्कृतियों में exocytosis की दरों का निर्धारण करने के लिए एक उपयोगी उपकरण है, खासकर जब ट्रांसफ़ेक्ट synapses और पड़ोसी नियंत्रण BOUTONS के बीच दरों की तुलना.

Protocol

चूहा (या माउस) प्राथमिक hippocampal neuronal संस्कृतियों (इन विट्रो में 14-28 दिन): कक्ष.

उत्तेजना: बिजली, दो प्लैटिनम इलेक्ट्रोड के माध्यम से दिया, 70-90 mV

माइक्रोस्कोपी: एक औंधा सीसीडी फ्लोरोसेंट खुर्दबीन पर 60x तेल लेंस.

सॉफ्टवेयर: Slidebook (सीए इंटेलिजेंट इमेजिंग नवाचार, सांता मोनिका,)

अधिक जानकारी के लिए पूरक तरीकों पृष्ठ देखें

  1. कमरे के तापमान पर गर्म HEPES बफर खारा (HBS). ग्लूटामेट रिसेप्टर antagonists (50 सुक्ष्ममापी अंतिम एकाग्रता) APV और CNQX (अंतिम 10 सुक्ष्ममापी) जोड़ें. प्रत्येक एफएम प्रयोग आमतौर पर 20-30 एमएल HBS की आवश्यकता है. 10 एफएम 4-64 सुक्ष्ममापी (आण्विक जांच) की एकाग्रता के लिए काम कर, HBS में शेयर 1:1000 समाधान जलमिश्रित (के साथ गरम जोड़ी). प्रत्येक प्रयोग के लिए 2 एमएल एफएम सोल्यूशन बनाओ. कवर पन्नी के साथ समाधान के लिए प्रकाश प्रदर्शन को रोकने के.

  2. माउंट coverslip इलेक्ट्रोड कक्ष पर न्यूरॉन्स युक्त. जाँच करें कि कक्ष में मीडिया कक्ष के शीर्ष के साथ स्तर है और पूरी तरह से इलेक्ट्रोड को शामिल किया गया. Coverslip के नीचे से किसी भी अतिरिक्त समाधान निकालें. लेंस (अगर एक तेल लेंस का उपयोग) के लिए तेल जोड़ें.

  3. छिड़काव तंत्र सेट. पानी, इथेनॉल, पानी, तो HBS: पहले दिया (हर एक प्रवाह अगले जोड़ने से पहले अच्छी तरह से चलो) आदेश में प्रत्येक निम्न में से कुछ एमएल के साथ कुल्ला. अगला HBS (भविष्य के चरणों में हाथ से जोड़ने के लिए कुछ एमएल को बचाने के लिए) को जोड़ने और छिड़काव बंद. Coverslip के किनारों पर छिड़काव और विपरीत पक्षों पर चूषण आउटलेट सेट. यह सबसे अच्छा है अगर छिड़काव आउटलेट चेंबर में पहुंचता है, जहां के रूप में चूषण बहुत शीर्ष पर आराम करना चाहिए. जबकि HBS (या तो छिड़काव द्वारा या हाथ से) जोड़ने, चूषण खोलने के लिए और अपनी स्थिति को समायोजित इतना है कि यह स्तर सिर्फ पूरी तरह से कवर इलेक्ट्रोड सही पर मीडिया का कहना है.

  4. Coverslip आप छवि को चाहते हैं और मोटे तौर पर यह ध्यान में लाने की कोशिश पर क्षेत्र के लिए देखो. इष्टतम क्षेत्रों में कई synapses के होते हैं, लेकिन ऐसी है कि व्यक्तिगत प्रक्रियाओं अप्रभेद्य हो जाते हैं नहीं चाहिए ताकि घने. वहाँ होना चाहिए नहीं कम से कम करने के लिए सेल निकायों, बाहरी झिल्ली (जैसे astrocytes के clumps), या अन्य nonspecific सामग्री (जैसे कि एक प्रकार का वृक्ष के रूप में). एफएम डाई nonspecifically इन का पालन कर सकते हैं.

  5. "विंग" फिल्टर क्यूब (जो हरी बत्ती के साथ उत्तेजित और लाल - दूर लाल उत्सर्जन एकत्र) का प्रयोग करें. Slideview कब्जा "वरीयताएँ" 10Hz पर छवि की शुरुआत पर 900 एपी देने सेट 0 (300 आमतौर पर 900 APs इस लोड हो रहा है उत्तेजना के लिए उपयोग किया जाता है). छवि विंडो में, "fluo की तुलना लाल" फ़िल्टर सेटिंग्स का चयन करें और 100 एमएस के लिए जोखिम समय बदलने. किसी भी पूर्व मौजूदा timelapse सेटिंग्स बंद करें. जब तक आप उत्तेजना शुरू करने के लिए तैयार कर रहे हैं किसी भी चित्र लेने मत करो.

  6. सुनिश्चित करें कि चूषण / खुला है. जल्दी चूषण के विपरीत छोर पर चैम्बर करने के लिए एफएम सोल्यूशन (2 एमएल) जोड़ें. तुरंत छवि विंडो में ठीक प्रेस के लिए एक छवि ले और उत्तेजना शुरू. उत्तेजना के बाद 30-45 सेकंड रुको और फिर जल्दी से बाहर ~ HBS (मैं एक विंदुक के साथ हाथ से इस करते हैं, लेकिन यह भी छिड़काव द्वारा किया जा सकता है) 2 एमएल जोड़कर एफएम धोने.

  7. HBS के साथ एफएम ~ 10 मिनट के लिए छिड़काव के माध्यम से धो लें. प्रवाह दर 1-1.5 एमएल / मिनट का होना चाहिए. इस धोने कदम के दौरान, उत्तेजना वरीयताओं को इतना है कि उत्तेजना की शुरुआत शुरू होता है को बदलने के @ 10 छवि (आमतौर पर 900 से 1200 ए पी एस @ 10 हर्ट्ज इस destaining प्रोत्साहन के लिए उपयोग किया जाता है). धोने में 7 मिनट के बारे में, डबल वरीयताएँ (उत्तेजना के 10 छवि पर शुरुआत) की जाँच करें. अब छोटे ध्यान केंद्रित विंडो का चुनाव और एक subregion ध्यान केंद्रित का उपयोग कर. यकीन है कि उत्तेजना सेटिंग अगले कदम के लिए आगे बढ़ने से पहले बदल दिया गया है. एक एकल छवि देखने के लिए अगर धोने पूरा हो गया है (synapses व्यक्ति को स्पष्ट रूप से चितला होना चाहिए) ले लो. यदि नहीं, प्रवाह दर एक अतिरिक्त 0.5mL/min बढ़ाने के लिए, और एक और 2 मिनट का इंतजार.

  8. धो एक बार पूरा हो गया है, आवश्यक के रूप में जोखिम समय समायोजित करने के लिए अभी भी एक अच्छा है, स्पष्ट संकेत प्राप्त (आमतौर पर 50-100 एमएस बार एक्सपोजर. बीच एफएम के तेजी से photobleaching के कारण कम से कम होना चाहिए). फिर timelapse वरीयताओं को सेट करने के लिए 38 छवियों को हर 5 सेकंड ले. छिड़काव को बनाने के लिए एक और 5 मिनट के लिए पर्याप्त HBS है की जाँच करें, और छोड़ छिड़काव बह. Timelapse प्रारंभ destaining शुरू.

  9. Destain के बाद, उत्तेजना सेटिंग्स बदलने के लिए 0 छवि पर एपी 1200 @ 10Hz (1200 से 2000 के लिए आम तौर पर APs के इस अंतिम चरण के लिए इस्तेमाल कर रहे हैं) देने के लिए. बंद timelapse सेटिंग्स मुड़ें और उत्तेजना शुरू करने के लिए एक एकल छवि ले. छिड़काव अभी भी बह यह कदम किसी भी शेष vesicular एफएम डाई निकालने में मदद करने के लिए, क्रम में करने के लिए आधारभूत / "कुल Releasable" प्रतिदीप्ति निर्धारित किया जाना चाहिए. उत्तेजना के बाद समाप्त हो गया है, उत्तेजना सेटिंग्स बारी, क्षेत्र के ध्यान में लाने के. छिड़काव और चूषण बंद, और फिर दो अंतिम आधारभूत छवियों को ले लो. या तो एकल छवियों या जेड ढेर छवियों (0.5 सुक्ष्ममापी कदम) को लिया जा सकता है. Z-ढेर उपयोगी होते हैं के मामले में प्रयोग के दौरान ध्यान देने की विमान में एक बदलाव किया गया था.

  10. आपका एफएम प्रयोग किया जाता है. यदि तुरंत और अधिक प्रयोगों कर, लेंस और चैम्बर प्रत्येक परीक्षण के बीच साफ किया जाना चाहिए, लेकिन छिड़काव तंत्र अंतिम प्रयोग के बाद जब तक साफ की जरूरत नहीं है. पानी, फिर इथेनॉल के साथ तंत्र पूरी तरह से कुल्ला.

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Discussion

के रूप में 300 कार्रवाई क्षमता (ए पी एस) पुटिका रीसाइक्लिंग के एक दौर, कम से कम 300 APs या अधिक बार vesicles की रीसाइक्लिंग पूल लेबल दिया जाता है की एक लोड हो रहा है उत्तेजना पैदा करने के लिए पर्याप्त है. हालांकि अधिक तीव्र 900 APs के रूप में लोड हो रहा है उत्तेजनाओं, करने के लिए अतिरिक्त लेबल हो vesicles की एक मामूली संख्या में अनुमति दे सकता है, यह भी डाई बाह्य झिल्ली में एम्बेड कर सकते हैं समय की राशि बढ़ जाती है, और अधिक से अधिक धुंधला गैर विशिष्ट अग्रणी. मैं धोने के लिए कदम उचित destaining सुनिश्चित करने के लिए महत्वपूर्ण हो पाया है. यह महत्वपूर्ण है प्रवाह प्रति मिनट 1 से 1.5 एमएल आमतौर पर 10 के लिए, दर + 2 मिनट के साथ perfuse. डाई हटाने की हद पर नजर रखने के एक एकल छवि को धोने में ~ 7 मिनट लिया जा सकता है. यदि आवश्यक हो, प्रवाह दर और या धोने समय थोड़ा बढ़ा जा सकता है है. हमारे प्रयोगों के लिए यह 10-12 मिनट से अधिक आगे बढ़ने के रूप में यह सहज exocytosis घटनाओं जो तब हो सकती है जब भी सेल आराम में है के माध्यम से पुटिका लेबलिंग को खोने की संभावना बढ़ जाती है धोने के लिए अवांछनीय था. Destaining कदम के लिए, 900 करने के लिए 1200 APs सभी लेबल vesicles रिहाई दिलाई गई. इसके अलावा एक और 1200 से 2000 APs अक्सर "Releasable प्रतिदीप्ति के आधारभूत मूल्य, destaining डेटा को मानक के अनुसार करने के लिए प्रयोग किया जाता प्राप्त करने के लिए दिया गया.

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
APV Sigma-Aldrich A5282
FM 4-64 Molecular Probes, Life Technologies T-3166
CNQX disodium salt Sigma-Aldrich C-239

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References

  1. Betz, W. J., Bewick, G. S. Optical analysis of synaptic vesicle recycling at the frog neuromuscular junction. Science. 255, 200-203 (1992).

Comments

4 Comments

  1. The data you can see on the screen look af if you see a lot of photobleaching. Is this true?
    How do you correct for this?

    Reply
    Posted by: Anonymous
    September 20, 2008 - 2:20 PM
  2. As in all fluorescence imaging experiments, bleaching can be corrected for in several ways.
    First, we use a sequence of frames where no stimulation was applied to obtain the bleaching rate
    (make sure to subtract a background region from all the frames). We then fit an exponential
    to this control background-subtracted data.
    Bleach(i) = Bleach(0)*exp(-i/tau) Then, we go back to the original data (minus the background) and apply the exponential correction.  F_corrected(i) = F(i)/exp(-i/tau)

    There are many descriptions of bleach correction on the web (just google).
    A nice description of bleach correction was recently described in:
    http://www.jneurosci.org/cgi/content/full/²5/19/4766/DC1 (see second supplementary material)
    A technical article on general calibration can be found in Journal of Microscopy, ²16:15-²4 (²004)
     

    Reply
    Posted by: Anonymous
    September 25, 2008 - 10:49 AM
  3. Thanks for this nice protocol.
    I started working with this technique and found your video really helpful.
    One question i would like to ask is related to the reproducability of this kind of experiments. Can you do repeated loading / unloadings on the same set of synapses?

    E.g., in my first experiments i use 600Ap/²0Hz stimuli for loading and destaining of the synapses, respectively. Image acquisation is done with with 1 Hz and a total of 70 images (²0 images before/after stimulation).

    While i get nice punctae with corresponding destaining curves in the first loading/unloading cycle, i found it vitually impossible to do a second round of stimulations at the same set of synapses. After the second loading the whole neurites become very bright, no punctae are identifiable and there is also no clear destaining, apart of photo bleaching.

    Can it be that the dye is damaging the synapses? (I use neutral density filters with ~5% transmission and select the exposure times as short as possible).

    Any comment or help on this is highly appreciated!

    Best,

    Paul

    Reply
    Posted by: Anonymous
    September 17, 2009 - 6:12 AM
  4. Paul,

    It is not uncommon to have difficulty for repeated staining. It is often related to one of two things:

    (i) Too much background: it is possible that you are ending up with too much surface stain with repeated loading and you are swamping the actual intravesicular signal. You can test this by skipping the labeling step in the first round - just stimulate as many times to mimic stainign and destaining, but don't add FM dye. Then, try the second round staining.

    (ii) The preparation becoming unhealthy either due to excessive electrical stimulation or phototoxicity. You can test this by skipping stimulation the first round and just have dye present for the same time, wash it out. Then, wait and do the second round as usual. To test phototoxicity, you can do staining and destaining in the first round, but just don't image at all. Then, start imaging only for the second staining.

    In the end, I am afraid that you may have to try several combinations of things.

    Best,

    -venki murthy

    Reply
    Posted by: Anonymous
    September 22, 2009 - 12:31 PM

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