FM 레이블을 사용하여 뉴런의 Exocytosis 측정

Biology

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Summary

소포 자료의 속도론을 측정하는 능력은 neurotransmission의 기초의 일부에 대한 통찰력을 제공할 수 있습니다. 여기 hippocampal의 연결을 문화에 presynaptic 소포 릴리스의 속도를 측정하기 위해 빨간색 형광 염료 FM 4-64으로 표시 vesicles의 실시간 이미지를 사용합니다.

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Newton, J., Murthy, V. Measuring Exocytosis in Neurons Using FM Labeling. J. Vis. Exp. (1), e117, doi:10.3791/117 (2006).

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Abstract

소포 자료의 속도론을 측정하는 능력은 neurotransmission의 기초의 일부에 대한 통찰력을 제공할 수 있습니다. 여기 presynaptic 소포 릴리스의 속도를 모니터 FM 염색으로 표시 vesicles의 실시간 이미지를 사용합니다. FM4 - 64은 endocytosis가 자극을 그대로 시냅스 vesicles의 점막에 내장 적색 형광 amphiphilic styryl 염료이다. Lipophilic 상호 작용은 염료가 크게 vesicles 및 소액 하나 세포외액에와 연관된 경우 따라서 밝은 신호를 방출, 형광의 증가 원인. 세척 단계는 플라즈마 막 내에서 외부 염료를 제거하는 데 사용 후 남은 FM은 vesicles 내에 집중되고 exocytosis이 전기 자극의 또 다른 라운드로 유도하면 다음 퇴학입니다. vesicles 릴리스의 속도는 형광의 발생 감소에서 측정됩니다. FM 염료가 transiently 외부 적용 될 수 있기 때문에 transfected 시냅스와 인접 제어 부튼스 간의 가격을 비교 특히, 문화의 연결에 exocytosis의 속도를 결정하기위한 유용한 도구입니다.

Protocol

셀 : 쥐 (또는 마우스) 기본 hippocampal의 연결을 문화 (체외에서 14~28일).

자극 : 전기, 두 백금 전극을 통해 전달; 70-90 MV

현미경 : 거꾸로 CCD 형광 현미경에서 60x 기름 렌즈.

소프트웨어 : Slidebook (지능형 이미징 혁신, 산타 모니카, CA)

자세한 내용은 보충 방법 페이지를 참조

  1. 따뜻한 HEPES 버퍼 상온에 호수 (HBS). 글루 탐 산염 수용체 antagonists APV (50 μm의 최종 농도)와 CNQX (10 μm의 최종)를 추가합니다. 각각의 FM 실험은 보통 20-30 ML HBS가 필요합니다. 10 μm의 FM 4-64 (분자 프로브)의 농도를 작업하기 위해 (antagonists가 추가로) HBS의 주식 솔루션 1:1000을 희석. 각 실험 2 ML FM soln하십시오. 빛의 노출을 방지하기 위해 호일로 솔루션을 커버.

  2. 전극 챔버에 신경을 포함하고있는 coverslip를 탑재합니다. 챔버의 미디어 챔버 상단과 수준임을 확인하고 완전히 전극을 다룹니다. coverslip의 바닥에서 초과 솔루션을 제거합니다. 렌즈 (석유 렌즈를 사용하는 경우)에 기름을 추가합니다.

  3. 재관류 장치를 설정합니다. 물, 에탄올, 물, 그리고 HBS : 먼저 주어진 순서 (다음을 추가하기 전에 철저하게 각 흐름을하자)에서 각각 다음의 몇 가지 ML와 린스. 다음 HBS를 (앞으로 단계에서 수동으로 추가할 수있는 몇 ML을 저장) 추가하고 재관류를 닫습니다. coverslip의 가장자리에서 반대편에 재관류 콘센트와 흡입을 설정합니다. 흡입이 매우 상단에 휴식한다 어디로 재관류 콘센트가 의회에 도달하면 그것은 최고입니다. HBS를 (중 재관류 또는 수동으로) 추가하는 동안 그것이 오른쪽에있는 미디어 수준 - 그냥 완전히 전극을 포함을 유지되도록, 흡입기를 열고 위치를 조정합니다.

  4. 이 이미지에 원하는 그리고 대략 그 초점을 유치하려고 coverslip에있는 지역을 찾아보십시오. 최적의 장소는 많은 시냅스를 포함하지만, 각각의 프로세스가 구별할 수 있도록되어 그러한 밀도해서는 안됩니다. 이 없어야 더 - - 최소로 세포 기관, 관계없는 점막 (예 : astrocytes의 대단히 짧은 시간 등), 또는 기타 특이 현상이 자료 (예 : 린트 등). FM의 염료가 nonspecifically 다음을 준수합니다.

  5. (녹색 불빛과 함께 흥분하고 빨간색 - 투 - 멀리 붉은 배출량을 수집) "WG"필터 큐브를 사용합니다. 0 (일반적으로 300 900 APS이 로딩 자극에 사용되는) 이미지의 증상에 따라 10Hz에서 900 AP를 제공하기 위해 Slideview "캡처 환경 설정"을 설정합니다. 이미지 창에서 "fluo - 마주 빨간색"필터 설정을 선택하고 100 MS에 대한 노출 시간을 변경합니다. 모든 기존 timelapse 설정을 해제합니다. 당신이 자극을 시작할 준비가되기 전까지는 어떤 이미지를하지 마십시오.

  6. 흡입가 / 열려 있는지 확인합니다. 빠르게 흡입의 반대 끝에 실로 FM soln (2 ML)를 추가합니다. 즉시 이미지를 가지고 자극을 시작하려면 이미지 창에서 괜찮 누르십시오. 자극 후 30-45 초 잠깐하고 신속하게 HBS (필자는 피펫과 수동으로이 작업을 수행하지만,이 또한 재관류에 의해 할 수있는)의 ~ 2 ML을 추가하여 FM을 씻으십시오.

  7. ~ 10 분 동안 재관류를 통해 HBS와 FM 씻으십시오. 흐름 속도는 1-1.5 ML / 분 있어야합니다. 이 세척 단계 동안, 자극의 증상이 시작되도록 자극 환경 설정을 변경 @ 이미지 10 조 (일반적 900-1200 APS @ 10 Hz에서이 destaining의 자극에 사용됩니다.) 세차로 7 분에 대하여 두 번 환경 설정 (그림 10 자극의 증상)을 확인하시기 바랍니다. 이제 작은 초점 창이 선택하고 subregion을 집중 사용합니다. 자극 설정 다음 단계를 진행하기 전에 변경되었습니다 있는지 확인하십시오. 세척이 완료되는지 확인하기 위해 하나의 이미지 (개인 시냅스가 명확하게 punctated한다)를 가져가라. 그렇지 않다면, 유량 추가 0.5mL/min을 증가하고, 다른 2 분 기다립니다.

  8. 일단 세척 완료 (FM의 급속한 photobleaching에 의한 최소화해야합니다 보통 50-100 MS. 노출 시간 사이) 아직 좋은 명확한 신호를받을 필요에 따라 노출 시간을 조정합니다. 그렇다면 38 이미지에게 5 초마다을 취할 수있는 timelapse 환경 설정을 설정합니다. HBS 다른 5 분 정도가 확인하기 위해 재관류를 확인하고, 재관류가 흐르는 둡니다. destaining 시작 timelapse 시작합니다.

  9. destain 후, 이미지 0시 1,200 AP @ 10Hz를 (일반적으로 1200 2000 APS이 마지막 단계에 사용되는) 제공하는 자극 설정을 변경합니다. timelapse 설정을 끄고 자극을 시작할 수있는 단일 이미지를 데리고. 재관류는 아직이 단계 기준 / "총 releasable"형광을 결정하기 위해, 남아있는 기공을 갖는 FM의 염료를 제거 도움이 될 것입니다 흐르는해야합니다. 자극이 완료되면, 자극의 설정을 해제 초점으로 지역을 가​​져. 재관류 및 흡입을 닫습니다다음이 마지막 기본 이미지를 가져가라. 단일 이미지 또는 Z - 스택 이미지 (0.5 μm의 단계) 중 하나는 촬영하실 수 있습니다. 실험 도중 초점 비행기에 변화가있을 수도 있으므로 Z - 스택은 유용합니다.

  10. 당신의 FM 실험 수행됩니다. 즉시 더 많은 실험을하는 경우, 렌즈와 챔버는 각 시험 사이에 청소를하지만, 재관류 기기는 최종 실험이 끝날 때까지 청소하지 않아도됩니다. 다음 물, 에탄올과 완전히 장치 린스.

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Discussion

300 행동 잠재력 (APS)는 소포 재활용 중 적어도 한 라운드, 300 APS 이상이 자주 라벨 vesicles의 재활용 풀에 주어진다의 로딩 자극을 유발하기에 충분 때문입니다. 같은 900 APS와 같은 강렬한 로딩 자극은, 표시되는 추가 vesicles의 호칭 번호를 허용할 수도 있지만, 이것은 또한 큰 불특정 얼룩에 이르는, 염료가 세포 세포막에 포함할 수있는 시간의 양을 증가시킵니다. 나는 적절한 destaining을 위해 중요한로 세척 단계를 발견했다. 보통 10 유량 분당 1-1.5 ML, + 2 분 perfuse하는 것이 중요합니다. 하나의 이미지는 염료 제거의 정도를 모니터링하는 ~ 7 분 세척으로 촬영하실 수 있습니다. 필요한 경우, 유량 및 또는 세척 시간은 약간 증가 수 있습니다. 실험을 위해 이것이 세포가 휴식을 경우에도 발생할 수 있습니다 자연 exocytosis 이벤트를 통해 소포 - 라벨링을 잃는의 가능성을 증가 10~12분보다 진행하기 위해 세척을 위해 바람직하지했다. destaining 단계에 대한, 900-1200 APS는 모든 레이블 vesicles를 공개 실시했다. 또한 다른 1200-2000 APS는 종종 destaining 데이터를 정상화하는 데 사용 "releasable 형광"의 기본 가치를 얻기 위해 주어진되었습니다.

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
APV Sigma-Aldrich A5282
FM 4-64 Molecular Probes, Life Technologies T-3166
CNQX disodium salt Sigma-Aldrich C-239

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Betz, W. J., Bewick, G. S. Optical analysis of synaptic vesicle recycling at the frog neuromuscular junction. Science. 255, 200-203 (1992).

Comments

4 Comments

  1. The data you can see on the screen look af if you see a lot of photobleaching. Is this true?
    How do you correct for this?

    Reply
    Posted by: Anonymous
    September 20, 2008 - 2:20 PM
  2. As in all fluorescence imaging experiments, bleaching can be corrected for in several ways.
    First, we use a sequence of frames where no stimulation was applied to obtain the bleaching rate
    (make sure to subtract a background region from all the frames). We then fit an exponential
    to this control background-subtracted data.
    Bleach(i) = Bleach(0)*exp(-i/tau) Then, we go back to the original data (minus the background) and apply the exponential correction.  F_corrected(i) = F(i)/exp(-i/tau)

    There are many descriptions of bleach correction on the web (just google).
    A nice description of bleach correction was recently described in:
    http://www.jneurosci.org/cgi/content/full/²5/19/4766/DC1 (see second supplementary material)
    A technical article on general calibration can be found in Journal of Microscopy, ²16:15-²4 (²004)
     

    Reply
    Posted by: Anonymous
    September 25, 2008 - 10:49 AM
  3. Thanks for this nice protocol.
    I started working with this technique and found your video really helpful.
    One question i would like to ask is related to the reproducability of this kind of experiments. Can you do repeated loading / unloadings on the same set of synapses?

    E.g., in my first experiments i use 600Ap/²0Hz stimuli for loading and destaining of the synapses, respectively. Image acquisation is done with with 1 Hz and a total of 70 images (²0 images before/after stimulation).

    While i get nice punctae with corresponding destaining curves in the first loading/unloading cycle, i found it vitually impossible to do a second round of stimulations at the same set of synapses. After the second loading the whole neurites become very bright, no punctae are identifiable and there is also no clear destaining, apart of photo bleaching.

    Can it be that the dye is damaging the synapses? (I use neutral density filters with ~5% transmission and select the exposure times as short as possible).

    Any comment or help on this is highly appreciated!

    Best,

    Paul

    Reply
    Posted by: Anonymous
    September 17, 2009 - 6:12 AM
  4. Paul,

    It is not uncommon to have difficulty for repeated staining. It is often related to one of two things:

    (i) Too much background: it is possible that you are ending up with too much surface stain with repeated loading and you are swamping the actual intravesicular signal. You can test this by skipping the labeling step in the first round - just stimulate as many times to mimic stainign and destaining, but don't add FM dye. Then, try the second round staining.

    (ii) The preparation becoming unhealthy either due to excessive electrical stimulation or phototoxicity. You can test this by skipping stimulation the first round and just have dye present for the same time, wash it out. Then, wait and do the second round as usual. To test phototoxicity, you can do staining and destaining in the first round, but just don't image at all. Then, start imaging only for the second staining.

    In the end, I am afraid that you may have to try several combinations of things.

    Best,

    -venki murthy

    Reply
    Posted by: Anonymous
    September 22, 2009 - 12:31 PM

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