FMラベリングを用いた神経細胞の測定エキソサイトーシス

Published 11/30/2006
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Biology

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Summary

小胞放出の動態を測定する能力は、神経伝達の基本のいくつかの洞察を提供することができます。ここでは、海馬ニューロン培養における前シナプス小胞の放出速度を測定するために赤色蛍光色素FM 4〜64で標識された小胞のリアルタイムイメージングを使用していました。

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Newton, J., Murthy, V. Measuring Exocytosis in Neurons Using FM Labeling. J. Vis. Exp. (1), e117, doi:10.3791/117 (2006).

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Abstract

小胞放出の動態を測定する能力は、神経伝達の基本のいくつかの洞察を提供することができます。ここでは、シナプス小胞放出の速度を監視するためのFM色素で標識された小胞のリアルタイムイメージングを使用していました。 FM4 - 64は、エンドサイトーシスを刺激されているシナプス小胞の膜に埋め込まれて赤色蛍光両親媒性のスチリル色素です。親油性の相互作用は、色素が大きく従って小胞と公称細胞外液に関連付けられている明るいシグナルを発し、蛍光の増加を引き起こす。洗浄工程が細胞膜内に外部色素を除去するために使用された後、残りのFMは、小胞内に濃縮し、その後、エキソサイトーシスは、電気刺激の別のラウンドにより誘導されたときに排出されます。小胞の放出速度は、蛍光の結果減少から測定されます。 FM色素が外部と一時的に適用できるので、それは、トランスフェクションしたシナプスと隣接する制御boutons間の金利を比較する場合は特に、ニューロン培養でエキソサイトーシスの速度を決定するための便利なツールです。

Protocol

細胞:ラット(またはマウス)の主海馬ニューロン培養(in vitroで14から28日間)。

刺激:電気、二つの白金電極を介して配信、70から90 mVの

顕微鏡:倒立CCD蛍光顕微鏡で60倍の油レンズ。

ソフトウェア:Slidebook(インテリジェントイメージングイノベーション、サンタモニカ、カリフォルニア州)

詳細については、補足的な方法のページを参照してください。

  1. 暖かいHEPES緩衝室温に生理食塩水(HBS)。グルタミン酸受容体拮抗薬APV(50μMの最終濃度)とCNQX(10μM最終)を追加します。各FMの実験は、通常20 mLのHBSが必要です。 10μMFM 4から64(Molecular Probes社)の濃度を操作するための、(拮抗薬が追加された)HBSのストック溶液1:1000に希釈する。各実験のために2 mLのFM solnを行います。光暴露を防止するために箔を備えたソリューションをカバーする。

  2. 電極室にニューロンを含むカバースリップをマウントします。チャンバー内のメディアは、チャンバーの上部と同じ高さと完全に電極を覆っていることを確認してください。カバースリップの下から余分な溶液を除去。レンズ(油のレンズを使用している場合)にオイルを追加。

  3. 灌流装置を設定します。水、エタノール、水、そしてHBS:最初の指定された順序(次を追加する前に、徹底的にそれぞれの流れを聞かせ)で、それぞれ次の数mLですすいでください。次のHBSを追加する(今後のステップに手作業で追加するには、数mlを保存)し、血流を閉じます。カバースリップの端で反対側の血流のコンセントと吸引を設定します。灌流のコンセントは、吸引力が非常に上部に休息する場所として、チャンバー内に達すると、それが最善です。 HBSは(どちらか灌流によるまたは手で)、吸引を開いて追加するとき、それは完全に電極を覆う右だけのレベルでメディアを維持するようにその位置を調整します。

  4. あなたがイメージすると、大体の焦点に持参しようとするとカバースリップ上の領域を探します。最適なエリアは多くのシナプスが含まれていますが、個々のプロセスがつかなくなるようなので、高密度であってはならない。ないから最小限の細胞体、余分な膜(例えば、星状膠細胞の塊のような)、または他の非特異的な材料(糸くずなど)がないはずです。 FMの染料は、非特異的にこれらに付着する場合があります。

  5. (緑色の光で励起し、赤から遠赤放射を収集する)"WG"フィルターキューブを使用してください。イメージ0の発症(一般に300 900のAPにこのローディングの刺激のために使用される)により10Hzで900 APを提供するSlideview"キャプチャ設定"を設定します。画像ウィンドウで、"蛍光 - 可視 - 赤"のフィルタ設定を選択して、100ミリ秒に露光時間を変更する。任意の既存のタイムラプスの設定をオフにします。あなたが刺激を開始する準備が整うまでの任意の画像を取ってはいけない。

  6. 吸引はオン/開いていることを確認してください。素早く吸引の反対側の端にある部屋にFM soln(2 mL)を加える。すぐに画像を取り、刺激を開始するために画像のウィンドウでは大丈夫押してください。刺激後30から45秒待ってから、すぐに(私はピペットで手でこれを行うが、これは血流によっても行うことができます)HBSの〜2 mLを加えることによりFMを洗い流す。

  7. 〜10分間灌流を経由してHBSとFMを洗ってください。流速は1から1.5 mL /分にする必要があります。この洗浄ステップの間、刺激の発症が始まるように刺激の設定を変更する@画像10(通常は900から1200のAP @ 10 Hzのがこの脱色刺激のために使用されています)。洗浄に7分程度、二重設定を(画像10の刺激の発症)確認してください。今すぐ小さなフォーカスウィンドウを使用すると、サブ領域を選択し、重点を置いています。刺激の設定が次のステップに進む前に変更されていることを確認してください。洗浄が完了したかどうかを確認するために単一のイメージ(個々のシナプスが明確にpunctatedする必要がある)を取る。されていない場合は、流量の追加0.5mL/minを増加させ、別の2分間待ちます。

  8. 一度洗浄が完了すると、まだ良い、明確な信号を(通常は50から100の間にミリ秒。露光時間はFMの急速な退色による最小化する必要がある)を受信するために、必要に応じて露光時間を調整します。その後、38個のイメージを5秒ごとに取ることタイムラプスプリファレンスを設定する。 HBSは、さらに5分間十分あるように血流を確認し、血流が流れるままに。脱色を開始するボックスに追加開始。

  9. 脱色した後、イメージ0時1200年のAP @ 10Hzのを(通常は1200〜2000のAPがこの最後のステップのために使用されている)を提供するための刺激の設定を変更してください。タイムラプスの設定をオフにして、刺激を開始するために単一のイメージを取る。血流は、まだこの段階ではベースライン/"総放出可能"蛍光を決定するために、残りの小胞FM色素を除去に役立つ通過している必要があります。刺激が終了した後、焦点に領域を持って、刺激の設定をオフにしてください。灌流と吸引を閉じますしてから、2つの最終的なベースラインの画像を撮影する。単一の画像やZ -スタック画像(0.5μmのステップ)のどちらかを取ることができる。実験時の焦点面のずれがあった場合には、Z -スタックが便利です。

  10. あなたのFM実験が行われます。すぐに多くの実験を行っている場合、レンズとチャンバーは各試行の間に掃除が、灌流装置は、最後の実験後まで掃除する必要はありませんする必要があります。その後、水、エタノールで完全に装置を洗浄します。

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Discussion

小胞のリサイクルの少なくとも一つのラウンドを誘導するのに十分である300活動電位(AP)のように、300台のAPまたは複数のローディング刺激は、しばしば小胞のリサイクルプールにラベルを付けるために与えられます。など900のAPのようなより強いローディング刺激が、、標識する追加の小胞の名目上の数を可能にするかもしれないが、これはまた、より非特異的な染色につながる、色素は細胞外膜に埋め込むことができる時間の量を増加させる。私は適切な脱色を確保するために重要であると洗浄のステップを発見した。それは通常10 + 2分間、流速を毎分1から1.5 mLを灌流することが重要です。単一のイメージは、色素の除去の程度を監視するために〜7分の洗浄に撮影することができます。必要に応じて、流量とや洗浄時間がわずかに増加することができます。私たちの実験のために、これが細胞が静止している場合でも発生する可能性のある自発的なエキソサイトーシスのイベントを介して小胞標識を失う可能性が高くて10〜12分を超えて続行するために洗浄のための望ましくないいました。脱色ステップでは、900から1200のAPがすべてのラベルの付いた小胞を解放するために投与した。さらに別の1200年から2000年のAPが頻繁に脱色データを正規化するために使用される"解放可能な蛍光"のベースラインの値を、取得するために与えられた。

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
APV Sigma-Aldrich A5282
FM 4-64 Molecular Probes, Life Technologies T-3166
CNQX disodium salt Sigma-Aldrich C-239

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References

  1. Betz, W. J., Bewick, G. S. Optical analysis of synaptic vesicle recycling at the frog neuromuscular junction. Science. 255, 200-203 (1992).

Comments

4 Comments

  1. The data you can see on the screen look af if you see a lot of photobleaching. Is this true?
    How do you correct for this?

    Reply
    Posted by: Anonymous
    September 20, 2008 - 2:20 PM
  2. As in all fluorescence imaging experiments, bleaching can be corrected for in several ways.
    First, we use a sequence of frames where no stimulation was applied to obtain the bleaching rate
    (make sure to subtract a background region from all the frames). We then fit an exponential
    to this control background-subtracted data.
    Bleach(i) = Bleach(0)*exp(-i/tau) Then, we go back to the original data (minus the background) and apply the exponential correction.  F_corrected(i) = F(i)/exp(-i/tau)

    There are many descriptions of bleach correction on the web (just google).
    A nice description of bleach correction was recently described in:
    http://www.jneurosci.org/cgi/content/full/²5/19/4766/DC1 (see second supplementary material)
    A technical article on general calibration can be found in Journal of Microscopy, ²16:15-²4 (²004)
     

    Reply
    Posted by: Anonymous
    September 25, 2008 - 10:49 AM
  3. Thanks for this nice protocol.
    I started working with this technique and found your video really helpful.
    One question i would like to ask is related to the reproducability of this kind of experiments. Can you do repeated loading / unloadings on the same set of synapses?

    E.g., in my first experiments i use 600Ap/²0Hz stimuli for loading and destaining of the synapses, respectively. Image acquisation is done with with 1 Hz and a total of 70 images (²0 images before/after stimulation).

    While i get nice punctae with corresponding destaining curves in the first loading/unloading cycle, i found it vitually impossible to do a second round of stimulations at the same set of synapses. After the second loading the whole neurites become very bright, no punctae are identifiable and there is also no clear destaining, apart of photo bleaching.

    Can it be that the dye is damaging the synapses? (I use neutral density filters with ~5% transmission and select the exposure times as short as possible).

    Any comment or help on this is highly appreciated!

    Best,

    Paul

    Reply
    Posted by: Anonymous
    September 17, 2009 - 6:12 AM
  4. Paul,

    It is not uncommon to have difficulty for repeated staining. It is often related to one of two things:

    (i) Too much background: it is possible that you are ending up with too much surface stain with repeated loading and you are swamping the actual intravesicular signal. You can test this by skipping the labeling step in the first round - just stimulate as many times to mimic stainign and destaining, but don't add FM dye. Then, try the second round staining.

    (ii) The preparation becoming unhealthy either due to excessive electrical stimulation or phototoxicity. You can test this by skipping stimulation the first round and just have dye present for the same time, wash it out. Then, wait and do the second round as usual. To test phototoxicity, you can do staining and destaining in the first round, but just don't image at all. Then, start imaging only for the second staining.

    In the end, I am afraid that you may have to try several combinations of things.

    Best,

    -venki murthy

    Reply
    Posted by: Anonymous
    September 22, 2009 - 12:31 PM

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