Het meten van exocytose in Neuronen FM-ontvanger voor Labeling

Biology

Your institution must subscribe to JoVE's Biology section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

De mogelijkheid om de kinetiek van blaasje los maatregel kan hulp bieden inzicht in een aantal van de basisprincipes van neurotransmissie. Hier gebruikten we real-time beeldvorming van blaasjes gelabeld met de rode fluorescente kleurstof FM 4-64 om de snelheid van presynaptische blaasje release in hippocampale neuronale culturen te meten.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Newton, J., Murthy, V. Measuring Exocytosis in Neurons Using FM Labeling. J. Vis. Exp. (1), e117, doi:10.3791/117 (2006).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

De mogelijkheid om de kinetiek van blaasje los maatregel kan hulp bieden inzicht in een aantal van de basisprincipes van neurotransmissie. Hier gebruikten we real-time beeldvorming van blaasjes voorzien van FM kleurstof om de snelheid van presynaptische blaasje los te controleren. FM4-64 is een rood fluorescerende amfifiele styrylkleurstoffen kleurstof die integreert in de membranen van synaptische blaasjes als endocytose wordt gestimuleerd. Lipofiele interacties zorgen dat de kleurstof om sterk te verhogen in fluorescentie, dus uitzenden van een helder signaal wanneer geassocieerd met blaasjes en een nominale een toen in de extracellulaire vloeistof. Na een wasstap wordt gebruikt om externe kleurstof te verwijderen binnen de plasmamembraan, wordt de resterende FM geconcentreerd in de blaasjes en wordt dan verwijderd wanneer exocytose wordt veroorzaakt door een andere ronde van elektrische stimulatie. De snelheid van blaasjes release is gemeten vanaf de daaruit voortvloeiende daling van de fluorescentie. Omdat FM kleurstof kan worden toegepast externe en tijdelijk, het is een nuttig hulpmiddel voor het bepalen van de tarieven van de exocytose in neuronale culturen, vooral bij het vergelijken van de tarieven tussen getransfecteerde synapsen en naburige controlegebieden boutons.

Protocol

Cellen: Rat (of muis) primaire hippocampale neuronale culturen (14-28 dagen in vitro).

Stimulatie: Elektrische, geleverd via twee platina-elektroden; 70-90 mV

Microscopie: 60x olie lens op een omgekeerde CCD fluorescentiemicroscoop.

Software: Slidebook (Intelligent Imaging Innovations, Santa Monica, CA)

Zie aanvullende methoden pagina voor meer details

  1. Warm HEPES-gebufferde zoutoplossing (HBS) op kamertemperatuur. Voeg de glutamaat receptor antagonisten APV (50 uM eindconcentratie) en CNQX (10 uM def.) Elke FM-experiment vereist meestal 20 tot 30 ml HBS. Voor het werken concentratie van 10 uM FM 4-64 (Molecular Probes), vul voorraad oplossing 1:1000 in HBS (met antagonisten toegevoegd). Maak 2 mL FM Soln voor elk experiment. Bedek oplossing met folie om blootstelling aan licht te voorkomen.

  2. Monteer de dekglaasje met de neuronen op de elektrode kamer. Controleer of de media in de kamer is het niveau met de bovenkant van kamer en volledig bedekt de elektroden. Verwijder eventuele overtollige oplossing van de onderkant van dekglaasje aan. Voeg olie aan de lens (bij gebruik van een olie-lens).

  3. Stel de perfusie apparaat. Eerst spoelen met een paar ml van elk van de volgende in de aangegeven volgorde (grondig laten elk een stroom voor het toevoegen van de volgende): water, ethanol, water, dan HBS. Voeg vervolgens de HBS (behoudens enkele mL toe te voegen met de hand in de toekomst stappen) en sluit de perfusie. Stel de perfusie stopcontact en de zuigkracht aan weerszijden aan de randen van het dekglaasje. Het is het beste als de perfusie outlet tot in de kamer, waar als de afzuiging dient te rusten op de top. Terwijl het toevoegen van HBS (hetzij door perfusie of met de hand), open de zuig-en pas de positie, zodat het houdt de media op het juiste niveau, net volledig over de elektroden.

  4. Kijk voor het gebied op het dekglaasje u wilt om de afbeelding en probeer ongeveer brengen in focus. Optimale gebieden bevatten veel synapsen, maar moet niet zo dicht zodat de individuele processen te onderscheiden te worden. Er mag geen-to-minimal cellichamen, vreemde membranen (zoals pollen van astrocyten), of andere niet-specifieke materialen (zoals lint). De FM-kleurstof kan zich aan deze niet-specifiek.

  5. Gebruik de "werkgroep" filter kubus (die prikkelt met groen licht en verzamelt rood-to-ver rode emissies). Stel SlideView "capture voorkeuren" om 900 AP leveren bij 10 Hz bij aanvang van de afbeelding 0 (meestal 300 tot 900 access points worden gebruikt voor het laden van deze stimulus). In het beeld-venster, selecteer de "fluo-vis-rood" filter instellingen en verander de blootstelling tijd tot 100 ms. Schakel alle reeds bestaande timelapse-instellingen. Neem geen foto's totdat u klaar bent om de stimulatie te starten.

  6. Zorg ervoor dat de zuigkracht is op / open. Snel toe te voegen van de FM-Soln (2 ml) om de kamer aan de andere kant van de zuigkracht. Meteen goed druk in de afbeelding venster om een ​​afbeelding te nemen en stimulatie beginnen. Wacht 30-45 seconden na stimulatie en dan snel wassen FM door het toevoegen van ~ 2 mL van HBS (Ik doe dit met de hand met een pipet, maar dit kan ook gebeuren door perfusie worden).

  7. Was de FM met HBS via perfusie voor ~ 10 minuten. Het debiet moet 1 tot 1,5 ml / min zijn. Tijdens deze wasstap, wijzigt u de stimulatie voorkeuren, zodat het begin van de stimulatie begint @ image 10 (meestal 900 tot 1200 AP @ 10 Hz worden gebruikt voor deze ontkleuren stimulus). Ongeveer 7 min in de was, controleer de voorkeuren (begin van de stimulus afbeelding 10). Nu het gebruik van de kleine focus venster kiezen en focus een subregio. Zorg ervoor dat de stimulatie-instellingen zijn gewijzigd voordat u verder gaat naar de volgende stap. Neem een ​​enkel beeld om te zien of de was is compleet (individuele synapsen moet duidelijk worden punctated). Zo niet, verhoging van de stroomsnelheid een extra 0.5mL/min, en wacht nog 2 minuten.

  8. Was eenmaal is voltooid, stelt u de belichting tijd als nodig is om nog steeds ontvangt een goed, duidelijk signaal (meestal tussen 50-100 ms. Belichtingstijden moet gevolg van de snelle fotobleken van de FM worden geminimaliseerd). Stel vervolgens de timelapse voorkeuren te nemen 38 beelden om de 5 seconden. Controleer de perfusie te maken is er genoeg HBS nog 5 minuten en laat perfusie stromen. Start timelapse om te beginnen ontkleuren.

  9. Na destain, veranderen stimulatie-instellingen tot 1200 AP @ 10Hz (meestal 1200-2000 AP's zijn gebruikt voor dit laatste stap) te leveren op afbeelding 0. Schakel de timelapse instellingen en neem een ​​enkel beeld voor stimulatie beginnen. De perfusie moet nog steeds stromen Deze stap zal helpen alle resterende vesiculaire FM kleurstof, om baseline / "totaal vrij te geven" fluorescentie te bepalen. Nadat de stimulus is voltooid, schakelt u de stimulatie-instellingen, te brengen in de regio in beeld. Sluit de perfusie en zuig, En neem dan twee laatste baseline beelden. Ofwel losse foto's of Z-stack beelden (0,5 micrometer stappen) kunnen worden genomen. Z-stacks zijn nuttig voor het geval er was een verschuiving in het vlak van de focus tijdens het experiment.

  10. Uw FM-experiment is gedaan. Indien onmiddellijk doen meer experimenten, moet de lens en de kamer schoongemaakt worden tussen elke proef, maar de perfusie apparaat hoeft niet te worden schoongemaakt pas na het laatste experiment. Volledig Spoel het apparaat met water, dan ethanol.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Als 300 actiepotentialen (AP's) is voldoende om tenminste een ronde van blaasje recycling, een laad-stimulus van 300 AP's of meer wordt vaak gegeven aan het etiket van de recycling pool van blaasjes veroorzaken. Hoewel de meer intense laden stimuli, zoals 900 AP, kan toestaan ​​dat een nominale aantal extra blaasjes te worden geëtiketteerd, dit verhoogt ook de hoeveelheid tijd die de kleurstof kan insluiten in extracellulaire membranen, wat leidt tot een grotere niet-specifieke kleuring. Ik heb de wasstap om kritisch om een ​​goede ontkleuren te garanderen. Het is belangrijk om perfuseren bij debiet 1 tot 1,5 ml per minuut, meestal gedurende 10 + 2 minuten. Een enkel beeld kan worden genomen ~ 7 minuten in de was in de mate van kleurstof verwijderen monitor. Indien nodig kan het debiet en of was de tijd iets worden verhoogd. Voor onze experimenten was het onwenselijk om de was te gaan groter dan 10-12 minuten, omdat dit verhoogt de kans op het verliezen van vesikel-labeling door spontane exocytose gebeurtenissen die kunnen optreden, zelfs wanneer de cel in rust is. Voor De ontkleuroplossing stap werden 900 tot 1200 AP toegediend om alle gelabelde blaasjes release. Daarnaast een ander 1200-2000 AP's zijn vaak gegeven aan een basiswaarde van "afgeefbare fluorescentie", wordt gebruikt om de data te normaliseren ontkleuroplossing te verkrijgen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
APV Sigma-Aldrich A5282
FM 4-64 Molecular Probes, Life Technologies T-3166
CNQX disodium salt Sigma-Aldrich C-239

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Betz, W. J., Bewick, G. S. Optical analysis of synaptic vesicle recycling at the frog neuromuscular junction. Science. 255, 200-203 (1992).

Comments

4 Comments

  1. The data you can see on the screen look af if you see a lot of photobleaching. Is this true?
    How do you correct for this?

    Reply
    Posted by: Anonymous
    September 20, 2008 - 2:20 PM
  2. As in all fluorescence imaging experiments, bleaching can be corrected for in several ways.
    First, we use a sequence of frames where no stimulation was applied to obtain the bleaching rate
    (make sure to subtract a background region from all the frames). We then fit an exponential
    to this control background-subtracted data.
    Bleach(i) = Bleach(0)*exp(-i/tau) Then, we go back to the original data (minus the background) and apply the exponential correction.  F_corrected(i) = F(i)/exp(-i/tau)

    There are many descriptions of bleach correction on the web (just google).
    A nice description of bleach correction was recently described in:
    http://www.jneurosci.org/cgi/content/full/²5/19/4766/DC1 (see second supplementary material)
    A technical article on general calibration can be found in Journal of Microscopy, ²16:15-²4 (²004)
     

    Reply
    Posted by: Anonymous
    September 25, 2008 - 10:49 AM
  3. Thanks for this nice protocol.
    I started working with this technique and found your video really helpful.
    One question i would like to ask is related to the reproducability of this kind of experiments. Can you do repeated loading / unloadings on the same set of synapses?

    E.g., in my first experiments i use 600Ap/²0Hz stimuli for loading and destaining of the synapses, respectively. Image acquisation is done with with 1 Hz and a total of 70 images (²0 images before/after stimulation).

    While i get nice punctae with corresponding destaining curves in the first loading/unloading cycle, i found it vitually impossible to do a second round of stimulations at the same set of synapses. After the second loading the whole neurites become very bright, no punctae are identifiable and there is also no clear destaining, apart of photo bleaching.

    Can it be that the dye is damaging the synapses? (I use neutral density filters with ~5% transmission and select the exposure times as short as possible).

    Any comment or help on this is highly appreciated!

    Best,

    Paul

    Reply
    Posted by: Anonymous
    September 17, 2009 - 6:12 AM
  4. Paul,

    It is not uncommon to have difficulty for repeated staining. It is often related to one of two things:

    (i) Too much background: it is possible that you are ending up with too much surface stain with repeated loading and you are swamping the actual intravesicular signal. You can test this by skipping the labeling step in the first round - just stimulate as many times to mimic stainign and destaining, but don't add FM dye. Then, try the second round staining.

    (ii) The preparation becoming unhealthy either due to excessive electrical stimulation or phototoxicity. You can test this by skipping stimulation the first round and just have dye present for the same time, wash it out. Then, wait and do the second round as usual. To test phototoxicity, you can do staining and destaining in the first round, but just don't image at all. Then, start imaging only for the second staining.

    In the end, I am afraid that you may have to try several combinations of things.

    Best,

    -venki murthy

    Reply
    Posted by: Anonymous
    September 22, 2009 - 12:31 PM

Post a Question / Comment / Request

You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

Usage Statistics