La medición de la exocitosis en las neuronas de un etiquetado FM

Published 11/30/2006
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Biology

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Summary

La capacidad de medir la cinética de liberación de vesículas puede ayudar a dar una idea de algunos de los fundamentos de la neurotransmisión. Aquí hemos utilizado imágenes en tiempo real de las vesículas marcadas con el tinte rojo fluorescente FM 4-64 para medir la velocidad de liberación de la vesícula presináptica en cultivos neuronales del hipocampo.

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Newton, J., Murthy, V. Measuring Exocytosis in Neurons Using FM Labeling. J. Vis. Exp. (1), e117, doi:10.3791/117 (2006).

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Abstract

La capacidad de medir la cinética de liberación de vesículas puede ayudar a dar una idea de algunos de los fundamentos de la neurotransmisión. Aquí hemos utilizado imágenes en tiempo real de las vesículas marcadas con FM tinte para controlar la velocidad de liberación de la vesícula presináptica. FM4-64 es un colorante fluorescente rojo anfifílicas estirilo que incrusta en la membrana de las vesículas sinápticas que se estimula la endocitosis. Interacciones lipofílicas hacer que el medio de contraste para aumentar en gran medida de la fluorescencia, por lo que emite una señal luminosa cuando se asocia con vesículas y uno nominal, cuando en el líquido extracelular. Después de una etapa de lavado se utiliza para ayudar a quitar el tinte externa dentro de la membrana plasmática, el resto de FM se concentra dentro de las vesículas y luego es expulsado cuando exocitosis es inducida por una nueva ronda de la estimulación eléctrica. La velocidad de liberación de las vesículas se mide desde la consiguiente disminución de la fluorescencia. Desde FM tinte se puede aplicar de forma transitoria y externa, es una herramienta útil para determinar las tasas de exocitosis en cultivos neuronales, especialmente cuando se comparan las tasas entre las sinapsis y transfectadas boutons vecinos de control.

Protocol

Las células: la rata (o ratón) cultivos primarios de hipocampo neuronal (14-28 días in vitro).

Estimulación: Eléctrico, entregado a través de dos electrodos de platino, 70 a 90 mV

Microscopía: la lente de 60x de aceite en un microscopio invertido CCD fluorescentes.

Software: Slidebook (Intelligent imágenes innovaciones, Santa Monica, CA)

Consulte la página métodos complementarios para obtener más detalles

  1. Caliente solución salina tamponada con HEPES (HBS) a temperatura ambiente. Añadir el glutamato, antagonistas de los receptores APV (50 mM concentración final) y CNQX (10 mM final). Cada experimento FM por lo general requiere de 20 a 30 mL HBS. Para trabajar la concentración de 10 mM FM 4-64 (Molecular Probes), diluir la solución madre 1:1000 en HBS (con antagonistas del autor). Haga 2 ml FM soln para cada experimento. Cubra con papel de solución para prevenir la exposición a la luz.

  2. Montar el cubreobjetos que contienen las neuronas en la cámara del electrodo. Compruebe que los medios de comunicación en la cámara está nivelada con la parte superior de la cámara y cubre completamente los electrodos. Elimine cualquier exceso de solución de fondo del cubreobjetos. Agregue el aceite de la lente (si se utiliza una lente de aceite).

  3. La instalación del equipo de perfusión. Enjuagar con unos pocos mL de cada uno de los siguientes en el orden indicado (cada uno a un flujo de fondo antes de añadir el siguiente): agua, etanol, agua, luego HBS. A continuación añadimos la EPF (salvo unos pocos mL para añadir a mano en los pasos futuros) y cerca de la perfusión. Configure la salida de la perfusión y la aspiración de la en lados opuestos en los bordes del cubreobjetos. Es mejor si la toma de la perfusión llega a la cámara, en tanto que la aspiración debe descansar en la parte superior. Mientras que la adición de HBS (ya sea por perfusión o con la mano), abra el aspirante y ajustar su posición para que mantenga los medios de comunicación a la derecha de nivel sólo se cubra totalmente los electrodos.

  4. Busque el área del cubreobjetos que desee a la imagen y tratar de llevar más o menos en el enfoque. Áreas óptimas contienen muchas sinapsis, pero no debe ser tan densa como la de que los procesos individuales se vuelven indistinguibles. No debe haber a un mínimo de cuerpos de las células, las membranas externas (tales como grupos de astrocitos), o de otros materiales específicos (tales como fibra). El colorante FM inespecífica puede adherirse a estos.

  5. Utilice la opción "WG" cubo de filtro (que excita con luz verde y roja se acumula a medida de las emisiones de color rojo). Establecer SlideView "preferencias de captura" para entregar 900 AP de 10 Hz a la aparición de la imagen de 0 (típicamente 300 a 900 puntos de acceso se utilizan para este estímulo de carga). En la ventana de la imagen, seleccione la opción "fluo-vis-rojo" ajustes de filtro y cambiar el tiempo de exposición de 100 ms. Apague todos los ajustes de timelapse pre-existentes. No tome alguna de las imágenes hasta que esté listo para comenzar la estimulación.

  6. Asegúrese de que la aspiración es el / abierto. Añadir rápidamente el soln FM (2 mL) a la cámara en el extremo opuesto de la succión. Inmediatamente presione bien en la ventana de imagen para tomar una imagen y empezar la estimulación. Espere 30-45 segundos después de la estimulación y luego lave rápidamente con FM mediante la adición de ~ 2 ml de HBS (lo hago a mano con una pipeta, pero esto también puede hacerse mediante la perfusión).

  7. Lave la FM con HBS a través de la perfusión de aproximadamente 10 minutos. El caudal debe ser 1-1,5 ml / min. Durante esta etapa de lavado, cambiar las preferencias de estímulo para que el inicio de la estimulación comienza @ imagen 10 (típicamente 900 a 1200 AP @ 10 Hz para este estímulo decoloración). Unos 7 minutos en el lavado, compruebe las preferencias (inicio de estímulo a la imagen 10). Ahora, utilizando el foco de la ventana pequeña elegir y el enfoque de una subregión. Asegúrese de que la configuración de estimulación han sido cambiados antes de proceder al siguiente paso. Tomar una imagen para ver si el lavado es completo (las sinapsis individuales deben estar claramente punteado). Si no es así, aumentar la tasa de flujo de un 0.5mL/min adicional, y esperar otros 2 minutos.

  8. Una vez lavado se completa, ajustar el tiempo de exposición necesario para recibir todavía una señal buena y clara (por lo general entre 50 a 100 ms. Tiempos de exposición debe reducirse al mínimo debido a la rápida photobleaching de la FM). A continuación, establezca las preferencias de timelapse de tomar 38 imágenes cada 5 segundos. Compruebe la perfusión para que haya suficiente EPF por otros 5 minutos, y dejar fluir la perfusión. Inicio timelapse para comenzar a decolorar.

  9. Después de destain, cambiar la configuración de estimulación para entregar 1200 AP @ 10Hz (por lo general desde 1200 hasta 2000 puntos de acceso se utilizan para este último paso) sobre la imagen 0. Desactivar la configuración de timelapse y tomar una sola imagen para empezar la estimulación. La perfusión debe seguir fluyendo Este paso le ayudará a eliminar cualquier resto de tinte vesicular FM, con el fin de determinar la línea de base / "total liberable" fluorescencia. Después de que el estímulo se termine, apague la configuración de la estimulación, traer a la región en foco. Cerca de la perfusión y aspiración, Y luego tomar dos imágenes de referencia final. Ya sea una sola imagen o Z-stack imágenes (pasos de 0,5 micras) se pueden tomar. Z-pilas son útiles en caso de que hubiera un cambio en el plano de enfoque durante el experimento.

  10. Su experimento se lleva a cabo FM. Si de inmediato hacer más experimentos, la lente y la cámara deben limpiarse entre cada prueba, pero el aparato de perfusión no necesita ser limpiado hasta después del experimento final. Enjuague el aparato completamente con agua, luego de etanol.

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Discussion

De 300 potenciales de acción (AP) es suficiente para inducir al menos una ronda de reciclaje de vesículas, un estímulo de carga de 300 puntos de acceso o más a menudo se da a la etiqueta de la piscina de reciclaje de vesículas. A pesar de los estímulos de carga más intensa, como 900 puntos de acceso, puede permitir que un número nominal de vesículas adicionales etiquetados, esto también aumenta la cantidad de tiempo que el tinte se puede integrar en las membranas extracelulares, lo que lleva a una mayor tinción no específica. He encontrado la etapa de lavado es crítico para asegurar la decoloración correcta. Es importante para la perfusión con una tasa de flujo de 1 a 1,5 ml por minuto, por lo general de 10 + 2 minutos. Una sola imagen puede ser tomado ~ 7 minutos en el lavado para vigilar el grado de eliminación de tinta. Si es necesario, el caudal y el tiempo de lavado o puede ser un poco mayor. Para nuestros experimentos no es deseable para el lavado de proceder más de 10-12 minutos ya que esto aumenta la probabilidad de perder la vesícula-etiquetado a través de eventos exocitosis espontánea que puede ocurrir incluso cuando la célula está en reposo. Para la fase de decoloración, 900 a 1200 puntos de acceso se administran a liberar a todos los etiquetados de las vesículas. Además otro AP 1200 a 2000 se dieron con frecuencia para obtener un valor de referencia de la "fluorescencia soltar", que se utiliza para normalizar los datos de decoloración.

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
APV Sigma-Aldrich A5282
FM 4-64 Molecular Probes, Life Technologies T-3166
CNQX disodium salt Sigma-Aldrich C-239

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References

  1. Betz, W. J., Bewick, G. S. Optical analysis of synaptic vesicle recycling at the frog neuromuscular junction. Science. 255, 200-203 (1992).

Comments

4 Comments

  1. The data you can see on the screen look af if you see a lot of photobleaching. Is this true?
    How do you correct for this?

    Reply
    Posted by: Anonymous
    September 20, 2008 - 2:20 PM
  2. As in all fluorescence imaging experiments, bleaching can be corrected for in several ways.
    First, we use a sequence of frames where no stimulation was applied to obtain the bleaching rate
    (make sure to subtract a background region from all the frames). We then fit an exponential
    to this control background-subtracted data.
    Bleach(i) = Bleach(0)*exp(-i/tau) Then, we go back to the original data (minus the background) and apply the exponential correction.  F_corrected(i) = F(i)/exp(-i/tau)

    There are many descriptions of bleach correction on the web (just google).
    A nice description of bleach correction was recently described in:
    http://www.jneurosci.org/cgi/content/full/²5/19/4766/DC1 (see second supplementary material)
    A technical article on general calibration can be found in Journal of Microscopy, ²16:15-²4 (²004)
     

    Reply
    Posted by: Anonymous
    September 25, 2008 - 10:49 AM
  3. Thanks for this nice protocol.
    I started working with this technique and found your video really helpful.
    One question i would like to ask is related to the reproducability of this kind of experiments. Can you do repeated loading / unloadings on the same set of synapses?

    E.g., in my first experiments i use 600Ap/²0Hz stimuli for loading and destaining of the synapses, respectively. Image acquisation is done with with 1 Hz and a total of 70 images (²0 images before/after stimulation).

    While i get nice punctae with corresponding destaining curves in the first loading/unloading cycle, i found it vitually impossible to do a second round of stimulations at the same set of synapses. After the second loading the whole neurites become very bright, no punctae are identifiable and there is also no clear destaining, apart of photo bleaching.

    Can it be that the dye is damaging the synapses? (I use neutral density filters with ~5% transmission and select the exposure times as short as possible).

    Any comment or help on this is highly appreciated!

    Best,

    Paul

    Reply
    Posted by: Anonymous
    September 17, 2009 - 6:12 AM
  4. Paul,

    It is not uncommon to have difficulty for repeated staining. It is often related to one of two things:

    (i) Too much background: it is possible that you are ending up with too much surface stain with repeated loading and you are swamping the actual intravesicular signal. You can test this by skipping the labeling step in the first round - just stimulate as many times to mimic stainign and destaining, but don't add FM dye. Then, try the second round staining.

    (ii) The preparation becoming unhealthy either due to excessive electrical stimulation or phototoxicity. You can test this by skipping stimulation the first round and just have dye present for the same time, wash it out. Then, wait and do the second round as usual. To test phototoxicity, you can do staining and destaining in the first round, but just don't image at all. Then, start imaging only for the second staining.

    In the end, I am afraid that you may have to try several combinations of things.

    Best,

    -venki murthy

    Reply
    Posted by: Anonymous
    September 22, 2009 - 12:31 PM

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