ES Cell-производные нейроэпителиальных клеточных культур

Biology

Your institution must subscribe to JoVE's Biology section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

Вывод нейроэпителиальных предшественников из эмбриональных стволовых (ЭС) клеток с использованием стромальных клеток-производных вызывающие активность (SDIA).

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations | Reprints and Permissions

Karki, S., Pruszak, J., Isacson, O., Sonntag, K. C. ES Cell-derived Neuroepithelial Cell Cultures. J. Vis. Exp. (1), e118, doi:10.3791/118 (2006).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

ЭС клетки обладают потенциалом дифференцироваться в клетки всех зародышевых листков, что делает их привлекательным инструментом для разработки новых методов лечения. В общем, дифференцировку ЭС клетки придерживается концепции сначала подготовить незрелых клеток-предшественников, которые затем могут быть распространены и дифференцировались в зрелых клеточных фенотипов. Это относится и к ЭСК полученных нейрогенез, в котором развитие нервных клеток является продолжением двух основных этапов: Во-первых, вывод и расширения незрелых нейроэпителиальных прекурсоров и во-вторых, дифференциация их в зрелые нервные клетки. Распространенным методом для производства нейронных прародителей из ЭС клеток основана на эмбриоидных тела (EB) образование, которое показывает, дифференцировки клеток от всех зародышевых листков в том числе нейроэктодермы. Альтернативный и более эффективный метод, чтобы побудить нейроэпителиальных развития клетка использует стромальных клеток-производных вызывающие активность (SDIA), которая может быть достигнута путем совместного культивирования ЭС клетки и черепа костномозгового происхождения стромальных клеток (1). Оба, Е. Б. формирования и SDIA, показывают развитие розетка-подобных структур, которые, как считается, напоминают нервной трубки и / или нервного гребня, как прародителей. Нейронных прекурсоров может быть изолирован, расширение и дальнейшее дифференцировались в специфических нейронов и глии клеток с использованием определенных условиях культуры. Здесь мы описываем поколения и изоляции таких розетки во взаимодействии культуры эксперименты с стромальных клеточных линий MS5 (2-5).

Protocol

Шаг 1

  1. Пластина митомицин-С ggrowth-тормозится (10 мкг / мл в течение 2,5 часов) MS5 клеток при плотности 70000 / см2 на желатин покрытием (0,01% в течение 30 минут) 6 луночных планшетах в α-MEM СМИ.
  2. Когда клетки прикрепляются и образовали монослоя (за одну ночь роста), переключиться на SRM.
  3. Вручную изолировать колонии ЭСК из ES культурах клеток с помощью шприца с 27 ½ G иглы.
  4. Tritrurate колонии тщательно с 1 мл синий наконечник и пластины при низкой плотности на MS5 клетки (обычно 2-3 колоний на 6-луночный планшет).

Примечание: ЭС клетки могут быть взяты из ферментативных распространения с применением коллагеназы или трипсина.

Шаг 2

  1. Расти ЭС клеток на MS5 питателей в течение 14-21 дней, пока розетки содержащих образуют колонии.


Примечание: Изменение СМИ часто. Розетки, как правило, на внешних краях колоний и их образование может быть значительно повышена, если 300-500 нг / мл Ноггин добавляется в SRM (3). В некоторых дифференциация протоколы, SRM можно обменять на N2-медиа и дополнены роста или другие факторы, чтобы способствовать ячейки спецификации (2-5).

Шаг 3

  1. Изолировать и подобрать розетки с 27 ½ G иглу под микроскопом.

Примечание: Не резки и выбрать MS5 стромальных клеток. Если колонии упакованы с розетками, можно также выделить всю колонию.


Шаг 4

  1. Аспирируйте кластеров розетки, tritrurate их тщательно с 1 мл синий наконечник, и пластины их на поли-L-орнитин (0,001%) и фибронектина (1 мкг / мл) или ламинин (1 мкг / мл) покрытием 6 скважин в N2-СМИ обычно дополнены bFGF (20 нг / мл). Розетки будут реформировать и расширить.

Примечание: Для повышения выживаемости клеток, можно пластины малых кластеров в каплях увеличить плотность клеток. Этот шаг также может быть изменена путем дополнения N 2-СМИ с дополнительным ростом или другие факторы, чтобы способствовать ячейки спецификации (2-5).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Этот протокол демонстрирует различные этапы в создании и изоляции нейроэпителиальных клеток из человеческих клеток ES использованием SDIA. Применение этого метода состоит в многообразии и была использована во многих протоколов для производства указанных нейронов (например, 1, 2, 5-9). Розетки, как полагают, напоминают нервные клетки трубки с передней фенотип (2, 5, 10), а также содержат нейронных прародителей гребне (11, 12). Кроме того, они сохраняют определенный уровень пластичности, так как они могут быть составлены по образцу конкретных факторов в определенных условиях культуры. Таким образом, SDIA полученных нейронных прародителей может дать начало многим типам клеток из центральной и периферической нервной системы делает их полезным инструментом для вывода различных нервных клеточных популяций в парадигмах ES клеточной дифференцировки.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Type Company Catalog Number Comments
L-Glutamine GIBCO, by Life Technologies 25030
alpha-MEM GIBCO, by Life Technologies 12571
Penicillin/streptomycin GIBCO, by Life Technologies 15140
Knockout-DMEM GIBCO, by Life Technologies 10829
Knockout serum replacement GIBCO, by Life Technologies 10828
MEM nonessential amino acid solution GIBCO, by Life Technologies 12383
DMEM/F12 GIBCO, by Life Technologies 11330
N2-A supplement Stem Cell Technologies 07152
Mitomycin-C Sigma-Aldrich M0503
Gelatine type-A Sigma-Aldrich G1890
poly-L-ornithine Sigma-Aldrich P4957 0.01% solution
Laminin Sigma-Aldrich L-2020
Fibronectin Sigma-Aldrich F2006
Basic fibroblast growth factor (bFGF) Invitrogen 13256
1 mL Syringe with 27 1/2 G needle BD Biosciences 309623
N2-A media medium DMEM/F12 + 1% N2-A supplement
Serum replacement media (SRM) medium Knockout-DMEM + 20% Knockout serum replacement +1% MEM nonessential amino acid solution + 2 mM L-glutamine
α-MEM media medium α-MEM + 10% FBS + 2 mM L-glutamine + 1% penicillin/streptomycin
MS5 cell line stromal cells
Microscope
6-well Plates for tissue culture

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Forthcoming.

Comments

2 Comments

  1. Where can we get MS5 stromal cell line?

    Sergey Akimov, JHU SOM

    Reply
    Posted by: Sergey A.
    June 24, 2010 - 12:00 PM
  2. Just now noticed your comment. I believe the easiest way to obtain MS5 cells is via DSMZ - (German Collection of Microorganisms and Cell Cultures; http://www.dsmz.de). The MS5 line is internal DSMZ no."ACC 441".

    Reply
    Posted by: Anonymous
    October 27, 2011 - 8:32 AM

Post a Question / Comment / Request

You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

Usage Statistics