ES Cell-נגזר תא תרבויות Neuroepithelial

Biology

Your institution must subscribe to JoVE's Biology section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

גזירת מבשרי neuroepithelial מ עובריים (ES) בתאי גזע באמצעות פעילות סטרומה תא הנגזרות גרימת (SDIA).

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations | Reprints and Permissions

Karki, S., Pruszak, J., Isacson, O., Sonntag, K. C. ES Cell-derived Neuroepithelial Cell Cultures. J. Vis. Exp. (1), e118, doi:10.3791/118 (2006).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

לתאי גזע עובריים יש פוטנציאל להתמיין לתאי מכל שכבות נבט, מה שהופך אותם לכלי אטרקטיבי לפיתוח טיפולים חדשים. באופן כללי, התמיינות של תאים עובריים מלווה את המושג ראשית ליצור ובתאים לא בשלה, אשר לאחר מכן ניתן מופצות הבדיל לתוך פנוטיפים הסלולר בוגרת. זה חל גם על neurogenesis תא הנגזרות ES, שבו את התפתחותם של תאים עצביים בעקבות שני שלבים עיקריים: ראשית, גזירת והרחבת מבשרי neuroepithelial בשלה בידול השני שלהם לתוך תאים עצביים בוגרת. שיטה נפוצה כדי לייצר אבות עצביים מתאי גזע עובריים מבוסס על היווצרות embryoid הגוף (EB), אשר חושף את התמיינות של תאים מכל שכבות נבט כולל neuroectoderm. שיטה חלופית ויעילה יותר כדי לגרום להתפתחות התא neuroepithelial משתמשת פעילות סטרומה תא הנגזרות גרימת (SDIA), אשר ניתן להשיג על ידי שיתוף culturing תאים ES עם מח עצם הגולגולת שמקורם בתאי סטרומה (1). שניהם, היווצרות EB ו SDIA, לחשוף את הפיתוח של רוזטה כמו מבנים, אשר נחשבים דומים עצביים צינור ו / או עצביים לפסגה, כמו אבות. מבשרי עצביים יכולים להיות מבודדים, התרחבה מובחן יותר לתוך נוירונים ספציפיים בתאי גליה תנאי שימוש תרבות מוגדרת. כאן, אנו מתארים את הדור ובידוד של רוזטות כאלה שיתוף תרבות ניסויים עם קו תא סטרומה MS5 ​​(2-5).

Protocol

שלב 1

  1. Mitomycin-C-פלייט ggrowth עכבות (10 מיקרוגרם / מ"ל ​​במשך 2.5 שעות) MS5 תאים בצפיפות של 70,000 / CM2 על ג'לטין מצופה (0.01% במשך 30 דקות) 6 צלחות היטב α-ממ התקשורת.
  2. כאשר תאים המחוברים ואת יצרו monolayer (מעל צמיחה לילה), לעבור SRM.
  3. ידנית לבודד תאים עובריים מושבות של תאים ES תרבויות באמצעות מזרק בעל מחט 27 ½ G.
  4. Tritrurate המושבות בזהירות עם קצה כחול 1 מ"ל ו צלחת בצפיפות נמוכה על MS5 תאים (בדרך כלל 2-3 מושבות בכל צלחת 6 היטב).

הערה: תאים ES יכולה גם להיות שנלקחו התפשטות אנזימטיות באמצעות collagenase או טריפסין.

שלב 2

  1. לגדול בתאים עובריים על MS5 ניזונים במשך 14-21 ימים עד ליצור מושבות שושנת המכילים.


הערה: המדיה שינוי לעיתים קרובות. רוזטות הן בדרך כלל בקצוות החיצוניים של המושבות היווצרות שלהם יכול להיות מאוד משופר אם 300-500 ng / ml noggin מתווספת SRM (3). בכמה פרוטוקולים בידול, SRM ניתן להחליף עם N2-מדיה שיושלם עם צמיחה או גורמים אחרים כדי לקדם את המפרט תאים (2-5).

שלב 3

  1. לבודד לבחור את רוזטות עם 27 ½ G מחט תחת מיקרוסקופ.

הערה: הימנע חיתוך לקטוף את MS5 בתאי סטרומה. אם המושבות עמוסים רוזטות, אפשר גם לבודד את המושבה כולה.


שלב 4

  1. לשאוב לאשכולות רוזטות, tritrurate אותם בקפידה עם טיפ 1 מ"ל כחול, צלחת אותם על פולי-L-ornithine (0.001%) ו פיברונקטין (1 מיקרוגרם / מ"ל) או laminin (1 מיקרוגרם / מ"ל) מצופה 6 בארות N2-מדיה להשלימו בדרך כלל עם bFGF (20 ng / ml). רוזטות תהיה רפורמה ולהרחיב.

הערה: כדי לשפר את הישרדות התא, אפשר הצלחת אשכולות קטנים טיפות להגדיל את צפיפות התאים. צעד זה גם יכול להיות שונה על ידי השלמת N2-מדיה עם צמיחה נוסף או גורמים אחרים כדי לקדם את המפרט תאים (2-5).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

פרוטוקול זה מדגים את השלבים השונים ליצירת ובידוד neuroepithelial תאים מתאי גזע עובריים אנושיים באמצעות SDIA. יישום של שיטה זו הוא סעפת נעשה שימוש בפרוטוקולים רבים לייצר נוירונים המצוין (למשל 1, 2, 5-9). רוזטות נחשבים דומים התאים בצינור העצבי עם פנוטיפ קדמית (2, 5, 10), מכילים גם אבות הרכס העצבי (11, 12). בנוסף, הם שומרים על רמה מסוימת של גמישות, כיוון שהם יכולים להיות בדוגמת על ידי גורמים מסוימים בתנאים תרבות מוגדרת. לפיכך, SDIA הנגזרות אבות עצביים יכול להצמיח סוגי תאים רבים ממערכת העצבים המרכזית היקפי שהופך אותם כלי שימושי הגזירה של אוכלוסיות תאים שונות עצבית בידול פרדיגמות ES התא.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Type Company Catalog Number Comments
L-Glutamine GIBCO, by Life Technologies 25030
alpha-MEM GIBCO, by Life Technologies 12571
Penicillin/streptomycin GIBCO, by Life Technologies 15140
Knockout-DMEM GIBCO, by Life Technologies 10829
Knockout serum replacement GIBCO, by Life Technologies 10828
MEM nonessential amino acid solution GIBCO, by Life Technologies 12383
DMEM/F12 GIBCO, by Life Technologies 11330
N2-A supplement Stem Cell Technologies 07152
Mitomycin-C Sigma-Aldrich M0503
Gelatine type-A Sigma-Aldrich G1890
poly-L-ornithine Sigma-Aldrich P4957 0.01% solution
Laminin Sigma-Aldrich L-2020
Fibronectin Sigma-Aldrich F2006
Basic fibroblast growth factor (bFGF) Invitrogen 13256
1 mL Syringe with 27 1/2 G needle BD Biosciences 309623
N2-A media medium DMEM/F12 + 1% N2-A supplement
Serum replacement media (SRM) medium Knockout-DMEM + 20% Knockout serum replacement +1% MEM nonessential amino acid solution + 2 mM L-glutamine
α-MEM media medium α-MEM + 10% FBS + 2 mM L-glutamine + 1% penicillin/streptomycin
MS5 cell line stromal cells
Microscope
6-well Plates for tissue culture

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Forthcoming.

Comments

2 Comments

  1. Where can we get MS5 stromal cell line?

    Sergey Akimov, JHU SOM

    Reply
    Posted by: Sergey A.
    June 24, 2010 - 12:00 PM
  2. Just now noticed your comment. I believe the easiest way to obtain MS5 cells is via DSMZ - (German Collection of Microorganisms and Cell Cultures; http://www.dsmz.de). The MS5 line is internal DSMZ no."ACC 441".

    Reply
    Posted by: Anonymous
    October 27, 2011 - 8:32 AM

Post a Question / Comment / Request

You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

Usage Statistics