Un In Vitro Prueba de irritación (SIT) con la epidermis humana reconstruida epidérmico (CHE) Modelo

Published 7/13/2009
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En este video, se demuestra la piel EpiDerm ensayo de irritación (EpiDerm SIT) elaborado y validado para

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Kandárová, H., Hayden, P., Klausner, M., Kubilus, J., Sheasgreen, J. An In Vitro Skin Irritation Test (SIT) using the EpiDerm Reconstructed Human Epidermal (RHE) Model. J. Vis. Exp. (29), e1366, doi:10.3791/1366 (2009).

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Abstract

El ensayo de irritación cutánea EpiDerm (EpiDerm SIT) se desarrolló

Protocol

I. Acondicionamiento de los tejidos - Día 0

  1. Tras la recepción de la epidermis del PAI-200-SIT, accede a todos los componentes del kit para la integridad (para más detalles véase el cuadro kit de reactivos y equipos específicos).
  2. Por cada tres tejidos EpiDerm, preparar una estéril de 6 pocillos precargada con 0,9 ml de medio de ensayo.
  3. En condiciones estériles, abra la bolsa de plástico que contiene la placa de 24 pocillos que contienen los tejidos EpiDerm y retire la gasa estéril.
  4. Usar pinzas estériles para eliminar cada inserción que contiene el tejido EpiDerm y el lugar de inserción en el vacío de 24 pocillos. Durante este paso, eliminar cualquier resto de agarosa de envío que se adhiere a los lados exteriores de la pieza por suaves secante sobre papel de filtro estéril.
  5. Dentro de los próximos 5 minutos, una inspección visual de los tejidos. No utilice los tejidos defectuosos o tejidos que están completamente cubiertas de líquido.
  6. Utilizando un hisopo de algodón punta estéril, seque la superficie de los tejidos. Trate de no tocar directamente el tejido - efectos capilares son suficientes para eliminar la humedad de la superficie del tejido.
  7. Después de secar la superficie del tejido, la transferencia de tres tejidos de la fila superior de las placas de 6 pocillos precargada con 0,9 ml de medio de ensayo. Liberar las burbujas de aire atrapadas debajo de los insertos.
  8. Coloque las placas de 6 pocillos que contienen los insertos en la incubadora por un 60 ± 5 min de pre-incubación a 37 ± 1 ° C, 5 ± 1% de CO 2, el 95% de HR (Humedad Relativa).
  9. A finales de los 60 ± 5 min de pre-incubación período, la transferencia de los insertos de los pozos de alta en los pozos inferior de la placa de 6 pocillos. Coloque las placas de nuevo en la incubadora (37 ± 1 ° C, 5 ± 1% de CO 2, el 95% de humedad relativa) para una noche de pre-incubación (18 ± 3 horas).
  10. Coloque el resto del medio de cultivo en el refrigerador (5 ± 3 ° C). Después de la noche a la mañana la pre-incubación, la sustancia de ensayo se puede aplicar a los tejidos EpiDerm.

    Nota: El procedimiento de pre-incubación puede acortarse en caso de entrega tardía del tejido (por ejemplo, si los tejidos llegan el miércoles en lugar del martes).

II. Exposición a sustancias químicas - Día 1

  1. Prepare una placa de 6 pocillos por cada sustancia de ensayo mediante la cumplimentación de la fila superior sólo con 0,9 ml por pocillo de medio de cultivo.
  2. Aproximadamente 5 minutos antes de la exposición prevista a los productos químicos, quitar las placas de 6 pocillos que contienen los tejidos pre-acondicionado de la incubadora.
  3. Evaluar la superficie de los tejidos y eliminar la humedad con puntas de algodón estéril.
  4. Etiqueta de todas las tapas placa de 6 pocillos con los códigos de ensayo de materiales o nombres.
  5. Dosis de los tejidos con la sustancia de ensayo a intervalos de 1 minuto para facilitar el lavado de los productos químicos de prueba después de la exposición. Mantener las placas con los tejidos dosis en la campana estéril, hasta el último tejido se dosifica.
  6. Para probar los productos químicos líquidos, prescindir de 30 l de la solución directamente sobre el tejido y colocar la malla de nylon en la superficie de los tejidos. Si es necesario, con cuidado la posición de la malla con el bulbo de vidrio dirigido pipeta Pasteur. No presione sobre la superficie del tejido.
  7. Para las pruebas semi-sólidos, el uso de una pipeta de desplazamiento positivo para prescindir de 30 l directamente sobre el tejido. Si es necesario difundir la sustancia química con la pipeta Pasteur para cubrir la superficie del tejido tanto como sea posible.
  8. Para los materiales sólidos, poco antes de la aplicación de la sustancia problema, humedezca la superficie del tejido, con 25 l de DPBS estéril. Esto permitirá mejorar el contacto de la superficie del tejido con la sustancia de ensayo. Llene una cuchara de 25 mg calibrado aplicación aguda (o cualquier otra herramienta apropiada), con aproximadamente 25 mg de material finamente pruebas en tierra. Aplicar la sustancia de ensayo sólidas a la superficie del tejido. Si es necesario, utilice una lámpara de cabeza con una pipeta Pasteur para vaciar la cuchara por completo. Agite suavemente los insertos para mejorar la difusión de los sólidos en la superficie.
  9. El caso de sustancias de consistencia cerosa, tratar de formar un piso "cookie como" pieza de 8 mm de diámetro y colóquelo sobre el tejido, que se humedece previamente con DPBS estéril. Para mejorar el contacto entre la sustancia de ensayo y el tejido, pesan la "cookie" con un acero inoxidable o de plástico ayuda.
  10. Aplicar DPBS como control negativo y el 5% SDS como control positivo en los tejidos control.
  11. Después de la administración del tejido pasado, la transferencia de todas las placas durante 35 ± 1 minutos de la incubadora humidificada (37 ± 1 ° C, 5 ± 1% de CO 2, el 95% de humedad relativa).
  12. Después de los 35 ± 1 minutos de incubación a 37 ° C retirar todas las placas de la incubadora. Coloque las placas en la cubierta estéril y esperar hasta que un período de 60 minutos de exposición química se ha completado para el primer tejido dosificado.
  13. Después de iniciar el procedimiento de lavado con la inserción de un intervalo de tiempo por minuto (para segurose que el tiempo total de exposición de cada inserción es de 60 minutos).
  14. Utilice una botella de lavado para lavar los tejidos con DPBS estéril. Rellene el tejido insertar 15 veces mediante el uso de un flujo constante de DPBS y se vacía. (Nota: para los tejidos con una malla de nylon, lave la superficie del tejido 5 veces y retire la malla cuidadosamente con las pinzas de punta, afilada Después, continúe con el resto de 10 lavados).
  15. Después del 15 de enjuague con la botella de lavado, sumergir completamente la inserción de 3 veces en 150 ml de DPBS y agitar para remover el resto del material de ensayo.
  16. Por último, enjuagar la inserción del tejido una vez desde el interior y una vez que desde el exterior con DPBS estéril.
  17. Eliminar el exceso de DPBS del tejido agitando suavemente la inserción, y borrando en el papel secante estéril.
  18. La transferencia de los insertos de tejido borrados de la nueva placa de 6 pocillos previamente pre-llenado con medio de cultivo. Todos estos pasos (14-18) se debe hacer dentro de 1 minuto para cada inserción.
  19. Después del último tejido se aclara, seque la superficie de cada tejido con un algodón estéril con punta de algodón.
  20. Incubar los tejidos en la incubadora para los próximos 24 ± 2 horas (37 ± 1 ° C, 5 ± 1% de CO 2, el 95% de humedad relativa).

    Nota: Cada técnico ensayo no debe probar más de 6 sustancias de prueba, incluyendo los controles negativos y positivos en una carrera de prueba solo (juego), para poder seguir el protocolo que se describe a continuación

III. Intercambio de soportes - Día 2

  1. Después de las 24 ± 2 horas post-incubación, la transferencia de los insertos en la parte inferior de la placa de 6 pocillos, precargada con 0,9 ml de los medios de comunicación. Los medios de comunicación de las filas superiores pueden ser recogidos para el análisis de los criterios de valoración adicionales (citocinas, quimiocinas, etc.) El análisis de los criterios de valoración secundarios es opcional.
  2. Continuar con la post-incubación (37 ± 1 ° C, 5 ± 1% de CO 2, el 95% de humedad relativa) por 18 ± 3 horas.

IV. MTT ensayo de viabilidad - Día 3

  1. Etiqueta de dos placas de 24 pocillos con los nombres químicos o códigos. Una placa servirá para la incubación del tejido con MTT y el otro para la etapa de extracción.
  2. Prepare la solución de MTT por el deshielo del concentrado de MTT (5 mg / ml) y diluir con el diluyente MTT. La concentración final de solución MTT es de 1 mg / ml.
  3. Pipetear 300 L de solución de MTT en cada pocillo de la placa de 24 pocillos.
  4. Retire las placas de 6 pocillos de la incubadora, mancha el fondo de los insertos en un papel secante, y transferirlos a la placa de 24 pozos pre-llenado con MTT.
  5. Coloque la placa de 24 pozos en la incubadora (37 ± 1 ° C, 5 ± 1% de CO 2, el 95% de humedad relativa) y se incuba durante 3 horas ± 5 min. Se adhieren estrictamente a las 3 horas ± 5 min tiempo de incubación para evitar la desviación entre las lecturas MTT diferentes.
  6. Cuando la incubación MTT, se debe utilizar una bomba de succión para aspirar suavemente el medio MTT de todos los pozos.
  7. Rellenar los pozos con DPBS y aspire de nuevo. Repita este lavado dos veces más y asegurarse de que los tejidos se sequen después de la aspiración última.
  8. Después de los lavados de transferencia de los insertos de una nueva placa de 24 pocillos. Sumerja los insertos pipeteando suavemente 2 ml de solución de extracción (isopropanol) en cada inserción. El nivel se elevará por encima de los bordes superiores de la inserción, por lo tanto completamente sumergido en los tejidos.
  9. Sellar la placa de 24 pocillos (por ejemplo, con Parafilm o el uso de la bolsa de sellado) para inhibir la evaporación de extracción. Extracto de la MTT de los tejidos por lo menos 2 horas a temperatura ambiente con agitación suave en un agitador de placas (~ 120 rpm). Extracción de la noche sin agitación también puede ser utilizado.
  10. Después del período de extracción, perforar los insertos con una aguja de inyección o una bombilla de cuentas pipeta Pasteur y permitir que el extracto para correr en el pozo de donde se tomó la inserción.
  11. Deseche el inserto perforado y una pipeta la solución en el bien de arriba abajo tres veces hasta que sea homogénea.
  12. Para cada tejido, la transferencia de dos alícuotas de 200 l de la solución de violeta de formazán en una placa de fondo de microtitulación de 96 pocillos plana. La transferencia de los duplicados de acuerdo con el diseño de la placa fijo establecido en la hoja de cálculo que acompaña a este protocolo de video. Para los blancos, el uso de isopropanol.
  13. Lea la densidad óptica (DO) de los extractos de MTT en un espectrofotómetro de placa de 96 pozos con una longitud de onda de 570 nm (540 a 580) sin un filtro de referencia.
  14. Introducir los resultados en la hoja de cálculo para el cálculo automático de los resultados (Figura 1).
  15. Una sustancia de ensayo es como 'irritante' (R38 o categoría del SGA 2) si la viabilidad de los tejidos por ciento determinado por el ensayo MTT es <50% con respecto al control negativo.

    Nota: MTT es tóxico, así que asegúrese de usar guantes protectores cuando maneje. Proteger MTT y su modoluciones de la luz, ya MTT es sensible a la luz. Use una solución de MTT en unas pocas horas después de su preparación ya que se degrada con el tiempo.

Calidad V. Ensayo controles

  • EpiDerm EPI-200-SIT kit Criterios de Aceptación:

    En modelos in vitro CHE deben proporcionar datos consistentes, de alta calidad con el tiempo, no sólo durante el proceso de validación (8). Las pautas recomendadas para asegurar la reproducibilidad a largo plazo del ensayo y el rendimiento son "una caracterización completa de las células o los tejidos, el muestreo de cada lote ... para el desempeño, y el uso regular de los controles y las sustancias químicas de referencia para ofrecer garantías de coherencia de sus resultados del ensayo" (9) . Además de los criterios de aceptación del ensayo se describen a continuación, cada lote de producción de EpiDerm es el control de calidad probado por el fabricante en contra de una sustancia química de referencia adicionales (1% Triton X-100). El tiempo de exposición necesario para reducir la viabilidad del tejido al 50% (ET-50) de Triton X-100 se determina. Para EpiDerm, promedio anual ET-50 los valores han oscilado entre 5,9 horas y 7,5 horas. El lote de CV muchos de los tejidos de control negativo (es decir, la variabilidad de la viabilidad de referencia) tiene un promedio inferior a 7,5% por cada año desde 1996. El valor ET50 de cada lote de producción debe estar dentro de dos desviaciones estándar de la media histórica Triton X-100 ET50 establecido en 1996 (es decir, ET-50 = 6,7 horas; límite inferior de aceptación = 4.8h; límite de aceptación superior = 8.7h) con el fin de ser liberado para su uso por el fabricante.

  • EPI-200-SIT ensayo de aceptación Criterio 1: Control negativo:

    El OD absoluta del control negativo (NC) tejidos (tratados con DPBS estéril) en el MTT-test es un indicador de la viabilidad del tejido obtenido en el laboratorio de pruebas, después del transporte y el almacenamiento de los procedimientos y condiciones específicas de uso. El ensayo cumple con el criterio de aceptación, si la media de la DO 570 de los tejidos NC es ≥ 1,0 y 2,5 ≤.

  • EPI-200-SIT ensayo de aceptación Criterio 2: Control Positivo

    Una solución al 5% de SDS (en H 2 O) se utiliza como control positivo (PC) y prueba al mismo tiempo que la sustancia de ensayo. Medios concurrentes que el PC tiene que ser probado en cada ensayo, pero no más de un PC se requiere por día de pruebas. La viabilidad del control positivo debe ser dentro de un intervalo de confianza del 95% de los datos históricos. El ensayo cumple con el criterio de aceptación, si la viabilidad media de los tejidos PC expresado en% de los tejidos de control negativo es del 20%.

  • EPI-200-SIT ensayo de aceptación Criterio 3: Desviación Estándar (SD)

    La irritación de la piel se predice a partir de la viabilidad media determinada sobre tres tejidos individuales y por lo tanto, la variabilidad de los tejidos replica debe ser aceptablemente bajo. El ensayo cumple con el criterio de aceptación si la SD calculado a partir de cada viabilidades% del tejido de los tres tratados de forma idéntica réplicas es <18%.

Resultados representante

Figura 1
Figura 2
Figura 3
Figura 1 Los resultados obtenidos durante 6 artículos de prueba, Carolina del Norte y el control de PC -. Parte de la hoja de cálculo automatizado para el cálculo de los resultados. Las sustancias de ensayo que reducía la viabilidad del tejido por debajo del 50% hace referencia a NC se clasifican como sustancias irritantes. La prueba ha sido optimizado para proporcionar resultados que sean lo suficientemente lejos de la clasificación de corte (50% de viabilidad) lo que aumenta la robustez del ensayo.

Materiales
Lista de Materiales

Discussion

En este vídeo, se ha demostrado la piel EpiDerm ensayo de irritación (EpiDerm SIT) elaborado y validado para las pruebas in vitro irritación de la piel de sustancias químicas, incluidos los ingredientes cosméticos y farmacéuticos. Al llevar a cabo este método, es importante trabajar en condiciones de asepsia y seguir estrictamente el protocolo validado, ya que la desviación del protocolo puede provocar resultados diferentes. Algunas de las modificaciones de la prueba es posible, sin embargo, los cambios en el protocolo se tratarán directamente con los autores.

La única limitación de este método es una posible interferencia de la sustancia problema con el extremo de MTT. Una sustancia de color o una que reduce directamente el MTT (y por lo tanto imita la actividad de la deshidrogenasa de la mitocondria celular) puede interferir con el extremo de MTT. Sin embargo, estas sustancia son un problema sólo si en el momento de la prueba de MTT (es decir, 42 horas después de la exposición de la sustancia) una cantidad suficiente de la sustancia todavía están presentes en (o dentro) de los tejidos. En el caso de este improbable caso, la reducción (true) MTT metabólicas y el aporte de un material de prueba de color o (falsa) de reducción de MTT directa por el material de prueba se puede cuantificar mediante un procedimiento descrito en detalle en el Procedimiento de Operación Estándar de ensayo proporcionado por MatTek Corp.

Acknowledgements

Los autores desean agradecer a ZEBET en el BfR (Alemania), BASF SE (Alemania), IIVS Inc. (EE.UU.), LSL-Zet (Austria) para participar en Multi-centro de estudio de validación internacional de la SIT Modificado EpiDerm (5 ).

References

  1. Kandárová, H., Liebsch, M., Genschow, E., Gerner, I. ngrid, Traue, D., Slawik, B., Spielmann, H. Optimization of the EpiDerm Test Protocol for the upcoming ECVAM Validation Study on In Vitro Skin Irritation Tests. ALTEX. 21, 107-114 (2004).
  2. Kandárová, H., Liebsch, M., Gerner, I., Schmidt, E., Genschow, E., Traue, D., Spielmann, H. EpiDerm Skin Irritation Test Protocol - Assessment of the performance of the optimized test. ATLA. 33, 351-367 (2005).
  3. Kandárová, H., Hayden, P., Klausner, M., Kubilus, J., Kearney, P., Sheasgreen, J. In Vitro Skin Irritation Test: Improving the Sensitivity of the EpiDerm Skin Irritation Test Protocol.Accepted for publication. ATLA. Forthcoming (2009).
  4. Spielmann, H., Hoffmann, S., Liebsch, M., Botham, P., Fentem, J., Eskes, C., Roguet, R., Cotovi, J., Cole, T., Worth, A., Heylings, J., Jones, P., Robles, C., Kandárová, H. The ECVAM International Validation Study on In Vitro Tests for Acute Skin Irritation: Report on the Validity of the EPISKIN and EpiDerm Assays and on the Skin Integrity Function Test. ATLA. 35, 559-601 (2007).
  5. Follow-up validation of the modified EpiDerm Skin Irritation Test (SIT): results of a multicentre study of twenty reference test substances. Liebsch, M., Gamer, A., Curren, R., Frank, J., Genschow, E., Tharmann, J., Remmele, M., Bauer, B., Raabe, H., Barnes, N., Hilberer, A., Wilt, N., Lornejad-Schäfer, M. R., Schäfer, C., Spiller, E., Hayden, P., Kandárová, H. 15th Congress on Alternatives to Animal Experimentation, 2008 September 19-21, Linz Austria, (2008).
  6. United Nations. Globally Harmonized System of Classification and Labeling of Chemicals (GHS). Second revised edition, UN. New York and Geneva. (2007).
  7. ESAC. Statement on the Scientific Validity of In-Vitro Tests for Skin Irritation Testing. ESAC. (2008).
  8. Gupta, K., Rispin, A., Stitzel, K., Coecke, S., Harbell, J. Ensuring quality of in vitro alternative test methods: Issues and answers. Regul Toxicol Pharmacol. 43, 219-224 (2005).
  9. Rispin, A., Stitzel, K., Harbell, J., Klausner, M. Ensuring quality of in vitro alternative test methods: Current practice. Regul Toxicol Pharmacol. 45, 97-103 (2006).

Comments

2 Comments

  1. What is the price for SIT kit?

    Reply
    Posted by: Anonymous
    December 6, 2011 - 3:15 PM
  2. Please direct your inquiry to bknapp@mattek.com

    Reply
    Posted by: Anonymous
    December 6, 2011 - 4:03 PM

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