Une In Vitro Test d'irritation cutanée (SIT) en utilisant le EpiDerm humaine reconstruite épidermique (RHE) Modèle

Published 7/13/2009
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Biology
 

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Dans cette vidéo, nous démontrons le test d'irritation cutanée EpiDerm (EpiDerm SIT) développée et validée pour

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Kandárová, H., Hayden, P., Klausner, M., Kubilus, J., Sheasgreen, J. An In Vitro Skin Irritation Test (SIT) using the EpiDerm Reconstructed Human Epidermal (RHE) Model. J. Vis. Exp. (29), e1366, doi:10.3791/1366 (2009).

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Abstract

Le test d'irritation cutanée EpiDerm (EpiDerm SIT) a été développésolution de MTT jaune et incubées pendant 3 heures. La résultante bleu-violet du sel de formazan, formée principalement par métabolisme mitochondrial, est extrait pendant 2 heures en utilisant l'isopropanol. La densité optique du formazan extraite est déterminé à l'aide d'un spectrophotomètre. Un produit chimique est classé comme un irritant si la viabilité des tissus par rapport à des tissus traités de contrôle négatif est réduit en dessous de 50%. Cette procédure peut être utilisée en remplacement complet de la peau in vivo chez le lapin test d'irritation pour l'identification des dangers et d'étiquetage des produits chimiques en conformité avec les règlements de l'UE

Protocol

Conditionné tissus I. - Jour 0

  1. Dès réception de la PEV EpiDerm SIT-200-kit, vérifier tous les composants du kit pour l'intégrité (pour plus de détails voir le tableau kit de réactifs et équipements spécifiques).
  2. Pour tous les trois tissus EpiDerm, préparer un stérile 6-même plaque de pré-rempli avec 0,9 ml de milieu de dosage.
  3. Dans des conditions stériles, ouvrez le sac en plastique contenant la plaque de 24 puits contenant les tissus EpiDerm et enlever la gaze stérile.
  4. Utilisez une pince stérile pour enlever chaque insert contenant les tissus EpiDerm et le lieu de l'insérer dans le vide de 24 puits à plaques. Durant cette étape, enlever tout reste d'expédition agarose qui adhère à la face externe de l'insert en douceur buvard sur du papier filtre stérile.
  5. Dans les 5 prochaines minutes, inspecter visuellement les tissus. Ne pas utiliser les tissus défectueux ou tissus qui sont entièrement recouvertes de liquide.
  6. Aide d'un écouvillon coton-tige stérile, sécher soigneusement la surface des tissus. Essayez de ne pas toucher le tissu directement - les effets capillaires sont suffisants pour éliminer l'humidité de la surface du tissu.
  7. Après séchage de la surface du tissu, de transfert trois tissus de la rangée supérieure des plaques de 6 puits pré-rempli avec 0,9 mL de milieu de dosage. Communiqué de bulles d'air piégées sous les inserts.
  8. Placez les plaques de 6 puits contenant les insère dans l'incubateur pendant 60 ± 5 min de pré-incubation à 37 ± 1 ° C, 5 ± 1% de CO 2, 95% HR (humidité relative).
  9. A la fin des années 60 ± 5 min de pré-période d'incubation, transférer les inserts dans les puits supérieures dans les puits inférieurs de la plaque à 6 puits. Placez les plaques de nouveau dans l'étuve (37 ± 1 ° C, 5 ± 1% de CO 2, 95% HR) pour une nuit de pré-incubation (18 ± 3 h).
  10. Placez le reste du milieu de dosage dans le réfrigérateur (5 ± 3 ° C). Après la nuit de pré-incubation, les produits chimiques d'essai peut être appliqué aux tissus EpiDerm.

    Remarque: La procédure de pré-incubation peut être raccourcie en cas de livraison tardive des tissus (par exemple si les tissus arrivent le mercredi au lieu du mardi).

II. Exposition aux produits chimiques - Jour 1

  1. Préparer une plaque de 6 puits par produit chimique de test en remplissant la rangée supérieure uniquement avec 0,9 ml par puits de milieu de dosage.
  2. Environ 5 minutes avant l'exposition prévue aux produits chimiques, enlever les plaques de 6 puits contenant des tissus pré-conditionné de l'incubateur.
  3. Évaluer la surface des tissus et enlever toute l'humidité à l'aide des conseils de coton stérile.
  4. Étiqueter tous les couvercles plaque à 6 puits avec les codes de matériel d'essai ou de noms.
  5. Dose les tissus avec les produits chimiques d'essai à 1 minute d'intervalle pour faciliter le rinçage de la chimie de test après l'exposition. Garder les assiettes avec les tissus dosé dans la hotte stérile, jusqu'à ce que le dernier tissu est dosé.
  6. Pour tester les produits chimiques liquides, dispenser 30 uL de la solution directement au-dessus du tissu et placer le filet de nylon à la surface des tissus. Si nécessaire, doucement la position du maillage en utilisant l'ampoule dirigée pipette Pasteur en verre. N'appuyez pas sur la surface du tissu.
  7. Pour les semi-solides essai, l'utilisation d'une pipette volumétrique de dispenser 30 uL directement au-dessus du tissu. Si nécessaire, le répandre chimique avec une pipette Pasteur pour couvrir la surface du tissu, autant que possible.
  8. Pour les matériaux solides, peu avant l'application de la substance d'essai, humidifier la surface du tissu avec 25 uL de DPBS stérile. Cela permettra d'améliorer de contact de la surface du tissu avec le produit chimique d'essai. Remplissez un 25 mg une cuillère calibrée de demande forte (ou tout autre outil approprié) avec environ 25 mg de matière broyée finement tests. Appliquer le produit chimique d'essai solide à la surface du tissu. Si nécessaire, utilisez une ampoule dirigée pipette Pasteur de vider complètement la cuillère. Secouez la inserts pour améliorer la diffusion de la solide sur la surface.
  9. Pour les substances de test avec une consistance cireuse, essayer de former un appartement "cookie comme« morceau d'environ 8 mm de diamètre et de le placer au-dessus du tissu, qui a été préalablement mouillée avec du DPBS stérile. Pour améliorer le contact entre substance d'essai et de tissus, alourdir le «cookie» avec un acier inoxydable ou en plastique d'aide.
  10. Appliquer DPBS que le contrôle négatif et 5% de SDS comme contrôle positif pour les tissus de contrôle.
  11. Après le dosage du dernier tissu, de transférer toutes les plaques pendant 35 ± 1 minutes à l'incubateur humidifié (37 ± 1 ° C, 5 ± 1% de CO 2, 95% HR).
  12. Après les 35 minutes d'incubation ± 1 à 37 ° C enlever toutes les plaques de l'incubateur. Placer les plaques dans la hotte stérile et attendre une période de 60 minutes d'exposition chimique est terminée pour le premier tissu dosé.
  13. Ensuite commence la procédure de lavage en utilisant les insérer une par intervalle de temps minute (pour assurancee que la durée totale d'exposition pour chaque insert est de 60 minutes).
  14. Utilisez une bouteille de lavage pour rincer les tissus avec du DPBS stérile. Remplissez le tissu insert 15 fois en utilisant un flux constant de DPBS et il vide (Remarque:. Pour les tissus avec un filet de nylon, laver la surface du tissu 5 fois et de supprimer le maillage soigneusement avec de l'a souligné, pince forte Ensuite, continuer avec le reste 10 lavages).
  15. Après le 15 rincez à l'aide de la pissette, immerger complètement l'insert 3 fois 150 ml et DPBS secouer pour enlever le reste du matériel d'essai.
  16. Enfin, rincez l'insert de tissu fois de l'intérieur et une fois de l'extérieur avec du DPBS stérile.
  17. Enlever tout excédent de DPBS du tissu en agitant l'insert, et il buvard sur le papier buvard stériles.
  18. Transférer les inserts de tissu effacé de la nouvelle plaque de 6 puits préalablement pré-remplies avec le milieu. Toutes ces étapes (14-18) doit être fait dans 1 min de chaque insertion.
  19. Après le dernier tissu est rincé, sécher soigneusement la surface de chaque tissu avec un coton-tige stérile.
  20. Incuber les tissus dans l'incubateur pour les prochaines 24 ± 2 heures (37 ± 1 ° C, 5 ± 1% de CO 2, 95% HR).

    Remarque: Chaque technicien essai ne doivent pas tester plus de six substances d'essai, y compris les contrôles négatifs et positifs dans une course de test unique (SET), pour être en mesure de suivre le protocole décrit ci-dessous

III. D'échange moyen - Jour 2

  1. Après les 24 ± 2 heures post-incubation, transférer les inserts dans la partie inférieure de la plaque de 6 puits, pré-remplis avec 0,9 ml de médias. Media de rangées supérieures peuvent être collectées pour l'analyse des critères d'évaluation supplémentaires (cytokines, chimiokines etc.) L'analyse des critères d'évaluation secondaires est facultative.
  2. Continuer avec le post-incubation (37 ± 1 ° C, 5 ± 1% de CO 2, 95% HR) pendant 18 ± 3 heures.

IV. Test de viabilité MTT - Jour 3

  1. Étiquette à deux plaques de 24 puits avec les noms des produits chimiques ou des codes. Une plaque servira pour l'incubation des tissus avec des MTT et l'autre pour l'étape d'extraction.
  2. Préparer la solution de MTT par le dégel du concentré de MTT (5 mg / ml) et le diluer avec le diluant MTT. La concentration finale de solution de MTT est de 1 mg / ml.
  3. Pipeter 300 uL de solution de MTT dans chaque puits de la plaque de 24 puits.
  4. Retirez les plaques de 6 puits de l'incubateur, éponger le fond des inserts sur un papier buvard, et de les transférer dans la plaque de 24 puits pré-rempli avec MTT.
  5. Placer la plaque de 24 puits dans l'étuve (37 ± 1 ° C, 5 ± 1% de CO 2, 95% HR) et incuber pendant 3 heures ± 5 min. Respecter strictement les 3 heures ± 5 min le temps d'incubation pour éviter l'écart entre les lectures différentes MTT.
  6. Lorsque l'incubation MTT est terminée, utilisez une pompe d'aspiration pour aspirer le support doucement MTT de tous les puits.
  7. Remplir le puits avec du DPBS et aspirer à nouveau. Répétez ceci deux fois plus de rinçage et de s'assurer que les tissus sont secs après l'aspiration dernier.
  8. Après les lavages de transférer les inserts d'une nouvelle plaque de 24 puits. Plongez délicatement les inserts par pipetage solution 2 ml d'extraction (isopropanol) dans chaque insert. Le niveau va augmenter au-dessus du bord supérieur de l'insert, donc complètement submerger les tissus.
  9. Sceller la plaque de 24 puits (par exemple avec Parafilm ou en utilisant sac d'étanchéité) pour inhiber l'évaporation d'extraction. Extrait du MTT à partir des tissus d'au moins 2 heures à température ambiante avec agitation douce sur un agitateur plaque (~ 120 rpm). Nuit d'extraction sans secouer peut aussi être utilisé.
  10. Après la période d'extraction est terminée, percent les inserts avec une aiguille d'injection ou l'ampoule perles pipette Pasteur et de permettre l'extrait de courir dans le puits à partir de laquelle l'insert a été prise.
  11. Jeter l'insert perforé et une pipette la solution dans le puits de haut en bas trois fois jusqu'à ce qu'elle soit homogène.
  12. Pour chaque tissu, de transfert à deux aliquots de 200 ul de la solution violette formazan dans une plaque de microtitration 96 puits à fond plat. Transférer les doublons en fonction de la conception plaque fixe donnée dans le tableur accompagnant ce protocole vidéo. Pour les blancs, utilisez l'isopropanol.
  13. Lire la densité optique (DO) des extraits de MTT dans un spectrophotomètre plaque de 96 puits en utilisant une longueur d'onde de 570 nm (540-580) sans filtre de référence.
  14. Inscrivez les résultats dans le tableur pour le calcul automatique des résultats (figure 1).
  15. Un produit chimique d'essai est étiqueté «irritant» (R38 ou de la catégorie 2 du SGH) si la viabilité du tissu pour cent déterminé par test MTT est <50% par rapport au contrôle négatif.

    Remarque: Le MTT est toxique, donc n'oubliez pas de porter des gants lorsque vous manipulez. Protéger MTT et sa soilutions de la lumière, puisque MTT est sensible à la lumière. Utiliser une solution de MTT dans quelques heures après sa préparation, car il se dégrade au fil du temps.

Qualité Assay V. Contrôles

  • EpiDerm PEV-200-SIT Critères d'acceptation kit:

    Dans les modèles in vitro RHE devrait fournir des données cohérentes, de haute qualité au fil du temps, pas seulement pendant le processus de validation (8). Lignes directrices recommandées pour assurer la reproductibilité de dosage à long terme et de rendement comprennent «une caractérisation complète des cellules ou des tissus, l'échantillonnage de chaque lot ... pour des performances et l'utilisation régulière des contrôles et des produits chimiques de référence pour fournir une assurance de la cohérence de la performance du test" (9) . En plus de critères d'acceptation de dosage décrites ci-dessous, chaque lot de production de EpiDerm de contrôle de qualité est testé par le fabricant contre un produit chimique de référence supplémentaire (1% de Triton X-100). Le temps d'exposition nécessaires pour réduire la viabilité des tissus à 50% (HE-50) pour le Triton X-100 est déterminée. Pour EpiDerm, moyenne annuelle HE-50 valeurs ont varié de 5,9 à 7,5 heures heures. Le lot de beaucoup CV pour les tissus de contrôle négatif (ie la variabilité de la viabilité de base) a été en moyenne moins de 7,5% pour chaque année depuis 1996. La valeur du ET50 chaque lot de production doit se situer à moins de 2 écarts-types de la moyenne historique Triton X-100 ET50 créé en 1996 (soit HE-50 = 6,7 heures; limite d'acceptation plus faible = 4.8h; limite d'acceptation supérieur = 8.7h) afin d'être libéré pour une utilisation par le fabricant.

  • EPI-200-SIT Assay acceptation Critère 1: Contrôle négatif:

    L'OD absolue du contrôle négatif (CN) des tissus (traités avec du DPBS stérile) dans le MTT-test est un indicateur de la viabilité des tissus obtenus dans le laboratoire d'essai après l'expédition et le stockage des procédures et des conditions spécifiques d'utilisation. Le test répond au critère d'acceptation si la moyenne des DO 570 des tissus NC est ≥ 1,0 et ≤ 2,5.

  • EPI-200-SIT Assay acceptation Critère 2: Contrôle positif

    Une solution à 5% de SDS (en H 2 O) est utilisé comme contrôle positif (CP) et testé concurremment avec les produits chimiques d'essai. Signifie Concurrent que le PC doit être testé dans chaque essai, mais pas plus d'un PC est requis par les tests par jour. Viabilité du contrôle positif doit se situer dans l'intervalle de confiance de 95% des données historiques. Le test répond au critère d'acceptation si la viabilité moyenne des tissus PC exprimée en% des tissus témoins négatifs est de 20%.

  • EPI-200-SIT Assay acceptation Critère 3: déviation standard (SD)

    Le pouvoir irritant pour la peau est prédite à partir de la viabilité moyenne déterminée sur 3 tissus unique et donc de la variabilité des tissus répétitions doit être suffisamment faible. Le test répond au critère d'acceptation si la SD calculée à partir de différents tissus viabilités% des 3 traités de façon identique répliques est <18%.

Les résultats représentatifs

Figure 1
Figure 2
Figure 3
Figure 1 Les résultats obtenus pour six articles d'essai, NC et de contrôle pour PC -. Une partie de la feuille de calcul automatisé pour le calcul des résultats. Test de produits chimiques qui ont réduit la viabilité des tissus en dessous de 50% référencé à NC sont classés comme irritants. Le test est optimisé pour fournir des résultats qui sont assez loin de la classification de coupure (50% de viabilité) augmentant ainsi la robustesse de l'analyse.

Matériaux
Liste des matériaux

Discussion

Dans cette vidéo, nous avons démontré le test d'irritation cutanée EpiDerm (EpiDerm SIT) a développé et validé par des tests in vitro d'irritation cutanée des substances chimiques, y compris les ingrédients des produits cosmétiques et pharmaceutiques. Lorsque vous effectuez cette méthode, il est important de travailler dans des conditions aseptiques et de suivre strictement le protocole validé, puisque déviation du protocole peut entraîner des résultats différents. Certaines modifications de l'essai sont possibles, cependant, des modifications au protocole doivent être discutés directement avec les auteurs.

La seule limitation de cette méthode est une ingérence possible de la substance d'essai avec le critère de MTT. Une substance d'essai ou d'une couleur qui réduisent directement MTT (et imite ainsi l'activité déshydrogénase des mitochondries cellulaires) peuvent interférer avec le résultat de MTT. Cependant, ces substance d'essai sont un problème seulement si, au moment du test MTT (soit 42 heures après exposition à la substance d'essai) des quantités suffisantes de la substance d'essai sont toujours présents sur (ou dans) les tissus. Dans le cas de cet événement peu probable, la réduction (vrai) MTT métaboliques et de la contribution par un matériel d'essai de couleur ou de (faux) la réduction du MTT directe par le matériel d'essai peut être quantifiée par une procédure décrite en détail dans la procédure de fonctionnement standard de dosage fournie par MatTek Corp

Acknowledgements

Les auteurs tiennent à remercier ZEBET au BfR (Allemagne), BASF SE (Allemagne), IIVS Inc (USA), Zet-LSL (Autriche) pour participer à étude multicentrique de validation internationale de la SIT à jour EpiDerm (5 ).

References

  1. Kandárová, H., Liebsch, M., Genschow, E., Gerner, I. ngrid, Traue, D., Slawik, B., Spielmann, H. Optimization of the EpiDerm Test Protocol for the upcoming ECVAM Validation Study on In Vitro Skin Irritation Tests. ALTEX. 21, 107-114 (2004).
  2. Kandárová, H., Liebsch, M., Gerner, I., Schmidt, E., Genschow, E., Traue, D., Spielmann, H. EpiDerm Skin Irritation Test Protocol - Assessment of the performance of the optimized test. ATLA. 33, 351-367 (2005).
  3. Kandárová, H., Hayden, P., Klausner, M., Kubilus, J., Kearney, P., Sheasgreen, J. In Vitro Skin Irritation Test: Improving the Sensitivity of the EpiDerm Skin Irritation Test Protocol.Accepted for publication. ATLA. Forthcoming (2009).
  4. Spielmann, H., Hoffmann, S., Liebsch, M., Botham, P., Fentem, J., Eskes, C., Roguet, R., Cotovi, J., Cole, T., Worth, A., Heylings, J., Jones, P., Robles, C., Kandárová, H. The ECVAM International Validation Study on In Vitro Tests for Acute Skin Irritation: Report on the Validity of the EPISKIN and EpiDerm Assays and on the Skin Integrity Function Test. ATLA. 35, 559-601 (2007).
  5. Follow-up validation of the modified EpiDerm Skin Irritation Test (SIT): results of a multicentre study of twenty reference test substances. Liebsch, M., Gamer, A., Curren, R., Frank, J., Genschow, E., Tharmann, J., Remmele, M., Bauer, B., Raabe, H., Barnes, N., Hilberer, A., Wilt, N., Lornejad-Schäfer, M. R., Schäfer, C., Spiller, E., Hayden, P., Kandárová, H. 15th Congress on Alternatives to Animal Experimentation, 2008 September 19-21, Linz Austria, (2008).
  6. United Nations. Globally Harmonized System of Classification and Labeling of Chemicals (GHS). Second revised edition, UN. New York and Geneva. (2007).
  7. ESAC. Statement on the Scientific Validity of In-Vitro Tests for Skin Irritation Testing. ESAC. (2008).
  8. Gupta, K., Rispin, A., Stitzel, K., Coecke, S., Harbell, J. Ensuring quality of in vitro alternative test methods: Issues and answers. Regul Toxicol Pharmacol. 43, 219-224 (2005).
  9. Rispin, A., Stitzel, K., Harbell, J., Klausner, M. Ensuring quality of in vitro alternative test methods: Current practice. Regul Toxicol Pharmacol. 45, 97-103 (2006).

Comments

2 Comments

  1. What is the price for SIT kit?

    Reply
    Posted by: Anonymous
    December 6, 2011 - 3:15 PM
  2. Please direct your inquiry to bknapp@mattek.com

    Reply
    Posted by: Anonymous
    December 6, 2011 - 4:03 PM

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