הכנס גדול הסביבה הגנום ספריית הפקה

Biology

Your institution must subscribe to JoVE's Biology section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

בניה של ספריה fosmid עם הדנ"א הגנומי הסביבה מבודדים רצף העומק האנכי של פיורד hypoxic עונתיות מתואר. הספרייה שיבוט המתקבל הוא הרים את 384 גם צלחות בארכיון עבור סידור במורד וסינון תפקודית על ידי יישום של מערכת המושבה אוטומטיות קטיף.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Taupp, M., Lee, S., Hawley, A., Yang, J., Hallam, S. J. Large Insert Environmental Genomic Library Production. J. Vis. Exp. (31), e1387, doi:10.3791/1387 (2009).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

הרוב המכריע של חיידקים בטבע כיום להישאר נגיש שיטות הטיפוח המסורתיות. במהלך העשור האחרון, תרבות עצמאית גנומית סביבתיים (

Protocol

הבנייה Fosmid ספריה כבר מחולק לארבעה שלבים עיקריים ותת מחולק למספר חלקים (ראו תמונה 1 עבור סקירה).

שלב אני (ראה פרוטוקול "מיצוי דנ"א 0.22 מסננים מיקרומטר Sterivex" [3])

חלק 1: אנזימים catalyzed תמוגה התא

חלק 2: טיהור של ה-DNA סביבתי על ידי צנטריפוגה שיפוע CsCl צפיפות והתאוששות DNA

חלק 3: בקרת איכות של ה-DNA שחולצו על ידי ג'ל אלקטרופורזה

שלב II

חלק 1: צעדים שינוי אנזימתי של ה-DNA הסביבה התאושש

ריאגנטים כל צעד הכרחי סוף התיקון של ה-DNA סביבתיים נכללים ערכת pCC1 ספריית Fosmid הפקה מ EPICENTRE. באופן אידיאלי, הדנ"א הגנומי שלך צריך להיות מותאם 0.5 מיקרוגרם / μl.

  1. הפשירי כל ריאגנטים על הקרח, לשלב את הבאים בקצרה צנטריפוגות צינור לקבל את כל נוזל לתחתית:
    • x מים סטריליים μl
    • 8 μl חיץ 10X סוף לתקן
    • 8 μl 2.5 dNTP לערבב mM
    • 8 μl 10 mM ATP
    • עד 20 מיקרוגרם טעון להכניס DNA (~ 0.5 מיקרוגרם / μl)
    • 4 אנזים μl סוף תיקון תמהיל
    • 80 μl התגובה הכולל נפח
  2. דגירה בטמפרטורת החדר למשך זמן מינימלי של 45 דקות עד 60 דקות בחום להשבית את תמהיל האנזים ב 70 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות (בזמן כלומר, להכין ג'ל נמוכה ההיתוך agarose לבחירה בגודל הבאות של סוף תוקן ה-DNA, ראה להלן).

חלק 2: גודל, מבחר של הדנ"א הגנומי ע"י אלקטרופורזה פעמו שדה ג'ל (PFGE)

  1. Re-להשעות 1.5 גרם של התכה נמוכה agarose ב 150 מ"ל של 1.0X טה ריצה חיץ להוסיף פס מגנטי קטן ומערבבים. מכסים את הבקבוק בניילון נצמד microwavable ומרתיחים במהירות במיקרוגל עד agarose נמס לחלוטין. מערבבים פתרון עד שהוא קר מספיק כדי למזוג לתוך מגש ג'ל (~ 60 ° C).
    הערה: לא לכלול ברומיד ethidium או זהב SYBR או בג'ל או למאגר פועל.
  2. להרכיב את מגש ג'ל להטיל ג'ל ולבחור מסרק אשר יתנו לכם מספיק מקום כדי לטעון את תערובת להשלים סוף לתקן את עפרות אחת שתיים בארות (80 μl בתוספת כמות מתאימה של חיץ טעינה).
  3. יוצקים 2.2 L של 1.0X טה לתוך תא אלקטרופורזה ולהדליק את המכשיר כדי להפיץ את המאגר פועל ולהגדיר את המכשיר קירור עד 14 ° C. המשאבה צריכה לרוץ 70 סיבובים לדקה, כדי להבטיח זרימת מספקת למאגר ריצה לשמור על חיץ על 14 ° C.
  4. יוצקים את agarose נמס לתוך מגש ג'ל על משטח מפולס היטב לאחר שהוא התקרר וודא שאתה למנוע בועות. ודא agarose נמס אפילו על מסרק את הג'ל, אחרת להסיר את המסרק והחזיר אותו לתוך agarose נמס. לאחר ג'ל הוא התגבש, להסיר את המסרק עומס בינוני אני PFG סמן היטב הרביעי של הג'ל. Extrude agarose מן המזרק ג'ל ופורסים תוסף קטן מסוף עם אזמל. חבר את תקע בחזית הבאר חותם עם agarose מותכת. מניחים את הג'ל לתוך תא אלקטרופורזה.
    הערה: ידית ג'ל agarose שלך ​​בזהירות רבה כמו בלם ההיתוך ג'לים נמוך בקלות. בדוק אם המאגר פועל מתקרר ל -14 מעלות צלזיוס לפני תחילת הטעינה ג'ל שלך. אם בארות שלך נראה נחסם על ידי agarose, לנסות בפעם הבאה הבאים: לפני שתסיר את המסרק של ג'ל, הוסף 1-2 מ"ל טה-חיץ סביב מסרק, זה יגרום בארות נחמד.
  5. ב μl לטעון הבאר הראשונה של 5 λ HindIII לעכל ואחריו μl 1 של הסמן לשלוט fosmid גודל (EPICENTRE, 100 ng / μl). הוסף 10 μl של מים סטריליים על מנת לסמן את גודל צינור microcentrifuge כמו גם הכמות המתאימה של חיץ הטעינה. נפח גדול יותר, קל יותר לטעון את הג'ל. ישירות ליד הסמן fosmid הטעינה שלך סוף תוקן חום מומת לערבב עם כמות מתאימה של חיץ הטעינה. סגור את המכסה התוכנית הגדרות.
    הערה: אנחנו באמת ממליצים טעינת כמויות שונות של DNA סולמות אחרים בערך לכמת את כמות ה-DNA או כדי להמחיש את היקף הגז של הדנ"א הגנומי שלך. סמני גודל אידיאלי הם λ-DNA HindIII לעכל בינוני אני PFG מרקר (הן חוד).
  6. תוכנית הגדרות: אלגוריתם אוטומטי להשתמש אם המערכת PFGE שלך מצויד הזה. התוכנית מחשבת באופן אוטומטי את ההגדרה אתה צריך להפריד בין ה-DNA של מגוון גודל נתון. הגדרות בשימוש הם: גודל DNA טווח 2-250 Kb; גורם כיול: 1; שיפוע: [6 V / cm]; זמן ריצה: 12:00 שעות; זווית כללו: 120 °, זמן המעבר הראשוני: 0.1 שניות; המעבר הסופי זמן : 21.79 שניות; גורם ramping ליניארי =.
  7. כדי להמחיש את הדנ"א שלכם, לשפוך 250 מ"ל של חיץ טה 1.0X לתוך מיכל ולהוסיף 25 μl של זהב SYBR 10.000X: לערבב בעדינות לפני שאתה במקום ג'ל שלך לתוך התמיסה. הכתם ג'ל שלך h 1 בחושך כמו SYBR זהב הוא רגיש לאור.
    הערה: להתמודד עם שלךgarose ג'ל בזהירות רבה כמו ג'לים התכה נמוכה הבלם בקלות.

חלק 3: ה-DNA התאוששות על ידי מיצוי ג'ל קשירת דנ"א התאושש וקטור שיבוט fosmid

ריאגנטים כל חלק זה כלולים בערכה EPICENTRE fosmid-ספריית הייצור.

  1. בינתיים להכין אמבט מים ב 70 ° C ואחד ב 45 ° C לצעד העיכול ג'ל.
  2. קחו ג'ל מוכתם שלך יחד עם שפופרת ריק microcentrifuge טיט ו אזמל סטרילי כדי transilluminator האור הכחול. דמיינו סוף תוקן שלך הדנ"א הגנומי ואת סמן fosmid גודל שליטה. פרוסה והבלו ג'ל עם אזמל כי נדדו עם מעט מעל המיקום של הסמן לשלוט fosmid גודל (פרוסה הבלו ג'ל וזה 5-7 מ"מ רחב) ולהעביר את הפרוסה על הצינור microcentrifuge טיט. הפעל בינוני אני PFG מרקר על ג'ל שלך זה עוזר לך לא לחתוך את הג'ל גבוה מדי.
    הערה: להניח בניילון נצמד על transilluminator האור הכחול לפני שאתה שם ג'ל שלך על זה כדי למנוע זיהום צולבות ללבוש את המשקפיים צפייה לפני הדלקת האור הכחול. אל פרוסות ג'ל הבלו שבו הדנ"א הגנומי הוא קטן יותר מאשר את הסמן לשלוט fosmid גודל כמו זה יגרום שיבוטים chimeric לא רצויות.
    ניתן לחתוך לפרוסות ולאחסן ג'ל המכיל נמוכות או גבוהות יותר DNA משקל מולקולרי לבניית רובה הגנום כולו או בספריות BAC, בהתאמה.
    עצור אני: את הפרוסה ג'ל התאושש (ים) ניתן לאחסן -20 ° C עד שנה אחת
  3. לשקול את צינורות טיט ולחשב את משקל הפרוסה ג'ל (ים). 1 מ"ג של agarose תניב כ 1 μl של agarose מותכת.
  4. ממיסים את ההיתוך agarose נמוך המכילים DNA הגנומי שלך באמבט המים 70 מעלות צלזיוס במשך 10-15 דקות (אנחנו לא להוסיף למאגר gelase). אחרי פרוסה ג'ל שלך הוא נמס לגמרי, להעביר את הצינור במהירות 45 ° C.
    הערה: לא מערבולת מדגם כדי לסייע המסת כמו זה עשוי גזירה הדנ"א שלכם.
  5. הוסף 1 U (1μl) של הכנת אנזימים GELase לכל 100 μl של agarose נמס. לדגור על 45 ° C למשך שעה ולאחר מכן להוסיף 1 GELase יותר (2-4 μl) ו דגירה במשך שעה נוספת. מחממים להשבית ההכנה אנזימים GELase על 70 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות.
    מניחים את הצינור על קרח למשך 10 דקות ו צנטריפוגות הצינור במהירות המרבית (13,000 סל"ד) במשך 15 דקות על כל גלולה חלקיקים מסיסים. הסר בזהירות את supernatant העליון ולהעביר אותו צינור פלקון 15 מ"ל ולהוסיף 3 מ"ל של מים סטריליים כדי הצינור.
    הערה: למנוע pipetting כל agarose pelleted. ככל שאנו מוסיפים יותר GELase כלול בערכה, אנו GELase תוספת אנזימים כדי הכנת בנפרד.
  6. העברת הפתרון יחידת Ultra-4 Amicon מסנן צנטריפוגלי עם קרום Ultracel-10 ו - ספין התחתית גרם 4,000 עבור 6-8 דקות וזורקים את הזרימה דרך. צנטריפוגה עד סכום של פתרון לסנן את מצטמצם בערך 100 ~ 500 μl. הוסף 3 מ"ל של מים סטריליים כדי הצינור פלקון ריק מלמעלה והעברת הפתרון הצינור Amicon וחזור על צעד צנטריפוגה. שטפי פעם שלישית עם 3 מ"ל מים להשליך לזרום שוב. הקטנת נפח סופי 50-100 μl.
    הערה: אנו משתמשים הרוטור דלי מתנדנד לשלב צנטריפוגה, פשוט במקום יחידת צנטריפוגלי Amicon מסנן את צינור פלקון 50 מ"ל כדי להחזיקו במקום במהלך צנטריפוגה. Amicon לסנן בבטחה שומרת 50 μl של פתרון לסנן גם לאחר צנטריפוגה המורחבת.
  7. מעבירים את פתרון ה-DNA שנותר מהצינור Amicon לתוך Microcon מראש שטף YM-50 יחידת מסנן צנטריפוגלי ולשטוף את הצינור Amicon μl עם 50 נוספות של מים סטריליים כדי לשחזר את כל ה-DNA. צנטריפוגה Microcon YM-50 יחידת מסנן צנטריפוגלי ב microcentrifuge בבית גרם עד 10,000 מסנן עדיין מכוסה עם מעט נוזל. בדוק בכל רגע אם רק כמות קטנה של נוזל נשאר על המסנן. סובבו את המסנן כלפי מעלה ומטה לשחזר את פתרון ה-DNA שלך על ידי צעד צנטריפוגה השני בבית ג'1000 עבור 3 דקות בתוך שפופרת microcentrifuge טריים. היקף וכתוצאה מכך לא יעלה על 10-15 μl בסך הכל, אחרת ה-DNA שלך יכול להיות מדולל מדי בשלב קשירת.
    הערה: להיזהר לא ספין המכשיר מסנן כדי להשלים יובש. אם הקרום שלך יבש, ולאחר מכן להוסיף 10-15 μl מים על גבי הממברנה, להתסיס בעדינות למשך 30 שניות לשחזר את הדנ"א שלכם כפי שתואר לעיל.
  8. לכמת פתרון ה-DNA שנוצר על ידי NanoDrop או assay PicoGreen.
  9. ששוחזרו בסוף לתיקון דנ"א עכשיו הוא מוכן להיות ligated כדי וקטור pCC1-fosmid השיבוט. להפשיר את הפתרון הבא על הקרח וודא וקטור להכניס יחס טוחנת היא 10:01.
    הערה: 0.5 מיקרוגרם pCC1-fosmid ~ 0.09 pmoles וקטור וקטור.
    0.25 מיקרוגרם של ~ 40 Kb להכניס DNA ~ 0.009 pmoles DNA להכניס
    הגדלת כמות ה-DNA נעשה שימוש בשלב קשירת עשוי להיות מועיל אם אתה צריך להשיג רק כמה שיבוטים fosmid לאחר ציפוי נגוע E. coli תאיםמבחר צלחות.

    מוסיפים את ריאגנטים בסדר להלן בקצרה צנטריפוגות צינור לקבל את כל נוזל לתחתית, לחץ על צינור ספין שוב:

    • x מים סטריליים μl
    • 1 μl קשירת 10X Fast-Link חיץ
    • 1 μl 10 mM ATP
    • 1 וקטור μl pCC1-fosmid (0.5 מיקרוגרם / μl)
    • x-DNA μl להכניס מרוכז (0.25 מיקרוגרם)
    • 1 DNA μl Fast-Link האנזים
    • 10 μl התגובה הכולל נפח
  10. דגירה בטמפרטורת החדר למשך 2 שעות בחום להשבית את האנזים במשך 10 דקות על 70 ° C.
    עצור ב ': תערובת חנות קשירת ב -20 ° C או להמשיך לשלב האריזה phage.
    הערה: התגובה קשירת אחד יפיק 10 -10 3 6 שיבוטים בהתאם לאיכות הסביבה של ה-DNA. בהתבסס על מספר משוער של שיבוטים הנדרש לכיסוי מסוים, אתה יכול הסולם את התגובה קשירת. אם קשירת הוא scaled למעלה, אז הסכום של תמצית אריזה phage צריך להיות scaled למעלה בהתאם כמתואר להלן.

שלב III

חלק 1: phage, אריזה של המוצר וקטור הכנס קשירת

  1. יומיים או שלושה לפני האריזה מיועד פס phage סיפק את EPI300-T1 זן R ציפוי על צלחת LB דגירה רגיל ושוב בלילה 37 ° C כדי להשיג מושבות אחת. צלחת זו יכולה להיות אטום מאוחסנים 4 ° C לשימוש עתידי.
  2. יום לפני 50 מ"ל התגובה לחסן אריזה של מרק LB + 10 mM MgSO 4 (להוסיף 500 MgSO 1M μl 4) עם מושבת אחד של הצלחת שנוצר בשלב 1. Shake ב 225 סל"ד ו - 37 ° C במשך הלילה.
  3. ביום התגובות אריזה לחסן LB מרק צח 50 מ"ל + 10 mM MgSO 4 עם 5 מ"ל של התרבות לילה מוכן בשלב 2. לגדול ב 37 ° C עד 600 OD של 0.8-1.0 ו - לא יעלה על 600 OD של 1.0! מדולל מדגם לפני מדידה על ספקטרופוטומטר, כך אתה מקבל תוצאה מדויקת. חנות תאים על הקרח או על 4 מעלות צלזיוס עד בשימוש עוד.
    הערה: עצור III: תרבות עשוי להיות מאוחסן על 4 מעלות צלזיוס עד 72 שעות במקרה הצורך, אולם באמצעות התרבות גדל טרי מומלץ מאוד.
  4. הפשרה, על קרח, למבדה תמציות MaxPlax אריזות, 1 שפופרת לתגובת כל קשירת ביצע בעבר. הפשרה ייקח 10-15 דקות. בינתיים, במקום צינור 1.5 מ"ל על הקרח להיות טרום צונן.
    הערה: לא להשאיר phage מופשר על הקרח זמן רב מדי. אחרת יעילות זיהום phage יירד.
  5. להפשיר מיד לאחר העברת 25 μl של תמצית כל אריזה צינורית שנייה טרום צונן mL 1.5 microfuge ומניחים על קרח. חזור לחלץ אריזה הנותרים - 80 ° C.
    הערה: אין לאחסן את תמצית האריזה עם קרח יבש או כל מקור אחר CO 2.
  6. הוסף 10 μl התגובה קשירת ל μl 25 כל אחד תמציות מופשר על הקרח. מערבבים על ידי pipetting הפתרון מספר פעמים, להימנע החדרת בועות אוויר. בקצרה צנטריפוגות הצינורות לקבל את כל נוזל אל החלק התחתון של הצינור דגירה התגובות אריזה של 30 מעלות צלזיוס למשך 90 דקות. לאחר 80 דקות של הפשרה הדגירה הנותרים לחלץ אריזה על הקרח.
    הערה: להשתמש באמבט מים ולא לחסום חימום הצעד הדגירה 30 מעלות צלזיוס.
  7. לאחר 90 דקות אריזה התגובה היא להשלים להוסיף את יתרת 25 μl של תמצית אריזה צינור כל תגובה. תגובות דגירה 90 דקות נוספות ב 30 ° C. לאחר 90 דקות הדגרה להוסיף 100 μl של הצפת דילול מוכן phage בצינור כל אריזה ומערבבים בעדינות.
    הערה: אם היעילות שלך צריך להיות נמוך בסוף, תמציות phage שלך יכול להיות זקן מדי או נחשפו קרח יבש או כל מקור אחר CO 2. מניסיוננו, אריזה phage בטמפרטורת החדר (2 פעמים 90 דקות) במקום 30 ° C ואחריו הדגירה נוסף סופי 2 שעות 30 ° C עלתה כמות השיבוטים שהתקבל.
  8. הוסף 5 μl של כלורופורם אל צינור כל ומערבבים בעדינות והתוצאה היא בהיקף כולל של 165 μl בצינור. משקע צמיג עלול להיווצר לאחר בנוסף כלורופורם, זה לא יפריע ייצור הספרייה. עם זאת להימנע המשקע וכן את שלב כלורופורם אורגני כאשר pipetting חלקיקי phage.
    עצור IV: בשלב זה החלקיקים phage ארוז עשוי להיות מאוחסן במשך מספר ימים בבית 4 ° C.
    הערה: את היעילות הטובה ביותר לזיהום phage, להשתמש phage ארוז טרי.

חלק 2: זיהום של המארח ספריה E. coli

  1. הוסף phage ארוז EPI300-T1 תאים R מארח (OD 600 = 0.8-1.0) ביחס של 400 μl של תאים EPI300-T1 R עבור μl 10 כל החלקיקים phage. כדי להימנע pipetting כל כלורופורם אנו משתמשים 125 μl של חלקיקים phage ארוז 5 מ"ל של EPI300-T1 תאים מוכן R המארח. מערבבים בעדינות ואז לדגור על 37 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות.
    הערה: להיזהר לא להעביר כלורופורם לתאי המארח כשמסירים את החלקיקים phage מהצינור אריזה phage. אם אינך בטוח, לקחת פחות של חלקיקים phage ארוזים.

חלק 3: ציפוי ו titering

  1. הוספת 5-7 חרוזי זכוכית מעוקר על LB four קטן + 12.5 מיקרוגרם / מ"ל ​​chloramphenicol בצלחות פטרי.
  2. מורחים פעמיים 50 μl ושני פעמים 10 μl של הפאג הנגוע EPI300-T1 תאים R על ארבע צלחות נפרדות. כדי להבטיח אפילו מתפשט, להוסיף קצת מרק LB (~ 50 μl) על צלחות עם 10 μl של תאים נגועים phage. לנער את הצלחת אופקית שווה להפיץ את התאים על הצלחת. בואו הצלחת יבש במשך 15 דקות ולאחר מכן להסיר את החרוזים על ידי היפוך לצלחת.
    הערה: אלה צלחות משמשות כדי לקבוע את מספר transformants ולחשב את דילולים המתאים הכרחי בשלב איסוף המושבה, כדי למנוע צפיפות המושבה גבוה מדי.
  3. מקמי את הצלחות הפוכות ב 37 ° C בחממה במשך 16 עד 24 שעות עד 48 שעות עד טופס מושבות. בדוק הצלחות לאחר 24 שעות כדי למנוע שיבוטים גדל במהירות של גדל לתוך מושבות השכן.
  4. בינתיים, קציר תאים שיורית שמאל מעל מזיהום 5 מ"ל על ידי צנטריפוגה ב 3500 גרם במשך 10 דקות ב 4 ° C. בטל supernatant. הוסף 1 LB mL / גליצרול 20% הצינור. Re-להשעות את התא ואת aliquot גלולה זה 100 μl כל 2 צינורות cryovial מ"ל. להקפיא מיד לחנות ב -80 ° C לשימוש נוסף במושבה קטיף צעד.
  5. למחרת, לספור את מספר שיבוטים על הצלחות ולקבוע את כייל. הקפד לכלול את הגורם לדילול הנכון כדי לחשב את הסכום הכולל של fosmid משובטים.
    הערה: הליך זה מייצר בין 10,000 ל 50,000 fosmid משובטים בסך הכל, אולם בהתאם לאיכות והטוהר של ה-DNA הסביבתי חילוץ, בטווח שבין 3,000 עד 80,000 שיבוטים fosmid הוא ציין.

שלב IV

חלק 1: אגר, היטב בהכנת לוחות

  1. יוצקים לתוך התקשורת צלחות כדלקמן; כוללים 12.5 chloramphenicol מיקרוגרם לכל LB מ"ל:
    • 100X15mm פטרי צלחת: אגר LB 25mL
    • 150X15mm פטרי צלחת: 50 מ"ל אגר LB
    • צלחת 245X245mm המבדק מרובע: אגר LB 250 מ"ל
    הערה: חשוב לשפוך את התקשורת על משטח מפולס היטב כדי להפוך עומק אגר באופן שווה על פני הצלחת. אנו ממליצים להשתמש 245X245 מ"מ צלחות לספריות fosmid אז אתה לא צריך להתמודד עם הצלחות רבות.
  2. המניה שלך הפשירי גליצרול המכיל את שיבוטים fosmid מוכן על הקרח. מורחים את הסכום המתאים עבור הצלחת ברצונך להשתמש על בסיס titer מחושב שלך (הכנת מלאי גליצרול בנוסף מתרכז בתאי שלך ~ פי 5). זמן הדגירה של צמיחת תאים היא 24 שעות 37 ° C.
    עצור V: כאשר הקים מושבות, חנות צלחות אגר חתם על 4 מעלות צלזיוס למשך עד חודש עד שהם משמשים בשלב המושבה קטיף.
    הערה: מושבות צריכים להיות מפוזרים באופן שווה, מספיק רחוקים אחד מהשני וצריך לגדול בכ 1 מ"מ קוטר. ציפוי תאים באמצעות חרוזי זכוכית יכול ליצור הפרדה טובה בין המושבות. על צלחת פטרי 100X15mm, בדרך כלל 150 ~ 250 מושבות הם צפיפות טוב היעילות הגבוהה ביותר לקטוף הרובוט במשך 22 x 22 ס"מ, יותר מ -2,000 מושבות לא צריך לקבל.
  3. בימים של מרים המושבה, להכין 96 או 384 גם צלחות מלאות מרק LB בתוספת chloramphenicol 12.5 מיקרוגרם לכל מרק מ"ל, כמו גם 20% גליצרול לאחסון הספרייה -80 ° C. ובכן צלחות מלאות במערכת QFill3 אוטומטיות צלחת מילוי כמתואר להלן.
  4. החיטוי 2 סטים של בקבוקי זכוכית (500 מ"ל), מכסים צינורות סיליקון. אל סעפת החיטוי, כולל הרכבה המחט מקורבות גובר. להרכיב QFill3 ליד להבה מבער בונזן או בתוך מכסה המנוע כדי ליצור ולשמור על סביבה סטרילית.
    הערה: לוודא כי צינורות סיליקון מוכנס לתוך השסתום קמצוץ על ידי לחיצה על שסתום קמצוץ activator ומחליקים בצינור במלואו לתוך השסתום. (זה פועל כמו בלם עבור מחלק בינוני עד הטור הבא).
  5. לעקר מחטים מחלק ידי עובר דרך 50 מ"ל ~ של אקונומיקה 1%, autoclaved DH 2 O ו - 80% אתנול, אחד בכל פעם, במקום המכסה תיבת קצה על פלטפורמת פתרונות לאיסוף פסולת. לאחר העיקור, לשנות כדי להגדיר את השני המורכב צינורות, בקבוק מכסה סיליקון.
  6. מלאו בקבוק עם 300 מ"ל ~ בינוני. הפעל די בינוני דרך להיפטר אתנול כל הנותרים משלב הניקוי. לאחר צינורות הוא ניקה, עומס צלחת גם 96/384 על הרציף. לחץ "התחל" כדי למלא את הצלחת שלך, כל טוב צריך להיות מלא עם 200 μl של מרק מוכן LB. כדי לנקות מחטים מחלק, לרוץ ~ 50 מ"ל של אתנול 80% דרך.
    הערה: הקפד היטב צלחת שלך מתויג לפני המילוי.

חלק 2: לקטוף מושבה ההתקנה רובוט

  1. אנחנו באמצעות שיבוט לקטוף רובוט QPix2 acמשתרגים אל במדריך של המשתמש. משתמשים צריך להיות מוכר טיפול הרובוט שלהם כיצד להגדיר את הכל כדי להבטיח את היעילות הגבוהה ביותר קטיף.
  2. כדי ליצור סביבה סטרילית מסביב לאזור לקטוף שיבוט, להדליק את האור UV במשך 30 דקות. בעוד אור UV על, להכין 500 מ"ל של אקונומיקה 1%, 500 מ"ל סטרילי DH 2 O ו - 500 מ"ל אתנול 80%. כאשר אור UV מכבה למלא את המגשים כפי שכותרתו. תמיד לשפוך את הפתרונות לתוך מגשי פתרון שכותרתו כהלכה. מהסוף להתחלה למלא אקונומיקה 1%, אזי autoclaved DH 2 O ו - 80% אתנול במגש הקדמי. ודא הם מלאים. מחטים קטיף לא ניתן לכבס כביסה כראוי ללא פתרון מספק.
    הערה: אתנול לפקח על 80% לאורך זמן. היא תתפוגג וצריך עקף למעלה.
  3. לאחר הגדרת הפרמטרים לקטיף אופטימלי, במקום צלחות אגר מוכן עם שיבוטים fosmid וצלחות היטב בין ההודעות באזור עבודה Q-Pix. ודא כי אתה לוקח כל צלחת מכסה את!
  4. צלחות צריך להיות צמוד בפינה הימנית הקדמית, ולכן הוא לא יכול לזוז במהלך קטיף. ואז לסגור את הפאנל הקדמי.
    הערה: זה מאוד חשוב!
  5. לאחר כל הפרמטרים נקבעים על הליך בחירת יכול להתחיל. כאשר כל לקטוף הושלמה לשטוף את המברשות ומגשים עם מים להגדיר deionized על הספסל לייבוש. לנקות את כל נשפך, אשר ייתכן שאירעו, ולנגב את הפנימי של Q-Pix עם אתנול 80%.

חלק 3: דגירה לינה ואחסון הספרייה

  1. ודא שכל המניות צלחות גליצרול מסומנים, ומניחים אותם על 37 מעלות צלזיוס החממה למשך 24 שעות. השאירו פתק על האינקובטור שמכיל את התאריך, מספר צלחות מודגרות, זמן הדגירה, זמן להסרת וראשי התיבות שלך.
  2. במשך זמן האחסון, את incubations גדלה והפכה בן לילה מקפיא -80 מעלות צלזיוס.

נציג תוצאות:

פרוטוקול הציג מתאר את הליך כיצד ליצור ספריה fosmid הסביבה כדי ללכוד את התוכן הגנטי של קהילה חיידקים גידול נתון. פרוטוקול זה אמור ליצור ספריה fosmid אשר נציג לתוכן גנטי של הסביבה שנדגמו צריך לאפשר לקורא לשנות לייעל את השלבים הקריטיים אם הסכום של שיבוטים fosmid שהושג בסוף ההליך כולו הוא נמוך מדי.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

ההליך מתואר כיצד היעיל ביותר ליצור ספרייה גדולה הכנס fosmid עם הדנ"א הגנומי נגזר מדגם מים החוף. Up-stream-DNA הגנומי מיצוי מתואר בפרוטוקול נפרד [3].

כפי הייצור fosmid-ספריית הוא רב שלבי תהליך, תוכנית לפחות שבועיים עד שלושה שבועות בזמן ההליך כולו, כולל כל הצעדים שהוצגו ארבע. החילוץ של הדנ"א הגנומי הוא הצעד החשוב ביותר וכל זרם למטה הצעדים מסתמכים על איכות וכמות של הדנ"א הגנומי חילוץ; כך לשקול מבלה מספיק בשלב זה לעבוד בזהירות. איכות ובקרת כמות ה-DNA חילוץ שלך היא מאוד חשובה. זה יכול לקרות כי מספר שיבוטים fosmid נמוך במיוחד אם זה הספרייה הראשונה שאתה הולך לעשות. כפי הבנייה ספריה fosmid כשלעצמו הוא ישר קדימה, כישלון נגרמת בעיקר על ידי איכות מספקת ו / או כמות ה-DNA חילוץ וטיהר שלך הגנומי. שקול מחדש את תמצית ה-DNA גנומי להקדיש תשומת לב מיוחדת את הצעדים הכרוכים טיהור-DNA התאוששות אם הבנייה הספריה שלך לא היה מוצלח.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

אין לי מה לחשוף.

Acknowledgments

ברצוננו להודות לקרן קנדית עבור חדשנות, פיתוח קולומביה הבריטית קרן ידע מדעי הלאומי וההנדסה מועצת המחקר (NSERC) של קנדה לתמיכה מחקרים מתמשכים על אזורים חמצן נמוכה של מים חופי האוקיינוס ​​הפתוח. MT ו - SL נתמכו על ידי מלגות ממרכז טולה היסוד במימון עבור גיוון התפתחות חיידקים (CMDE). MT גם קיבל מלגת תמיכה של דויטשה Forschungsgemeinschaft (DFG).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Step II
CopyControl™ Fosmid Library Production Kit Epicentre Biotechnologies CCFOS110 sufficient to generate 9-10 fosmid libraries
SeaPlaque Agarose Cambrex 50100
stirring hot plate Corning PC-420D
1.0X TAE running buffer
CHEF Mapper XA pulsed field electrophoresis system including cooling module and variable speed pump Bio-Rad
λ DNA-HindIII Digest New England Biolabs N3012S
MidRange I PFG Marker New England Biolabs N3551S
10,000X SYBR Gold Invitrogen S11494
microwavable plastic wrap Saran premium wrap
Safe Imager transilluminator Invitrogen S37102
GELase Agarose Gel-Digesting Preparation Epicentre Biotechnologies G09100
scalpel Fisher Scientific 08-927-5D
Amicon Ultra-4 Centrifugal Filter Unit with Ultracel-10 membrane EMD Millipore UFC801024
Microcon YM-30 Centrifugal Filter Unit EMD Millipore 42410
nuclease free water Ambion AM9932
Quant-iT PicoGreen dsDNA Assay Kit *2000 assays*# Invitrogen P7589
digital dry block heater VWR international 12621-088
water bath VWR international 14231-854
centrifuge Beckman Coulter Inc. Avanti J-E
centrifuge rotor Beckman Coulter Inc. JA 5.3
table top centrifuge Eppendorf 5415D
microcentrifuge tubes, 1.7 mL, clear Axygen Scientific MCT-175-C
15 mL centrifuge tubes Fisher Scientific 430052
Step III
LB broth Fisher Scientific BP 1426-2
MgSO4 Sigma-Aldrich M2643
phage dilution buffer 10 mM Tris-HCl [pH 8.3], 100 mM NaCl, 10 mM MgCl2
cryogenic vials Fisher Scientific 430488
Step IV
96 well plate with lid Fisher Scientific CS003370(3370)
384 well plate with lid Fisher Scientific 07201157(3680)
Petri dishes 100 O.D. x 15mm H Fisher Scientific 08-757-12
Petri dishes 150 Dia. x 15mmH Fisher Scientific 08-757-14
BD Falcon BioDish XL 245 X 245 mm VWR international CABD351040
glycerol Sigma-Aldrich G5516
chloramphenicol Sigma-Aldrich C0378
LB broth Fisher Scientific BP 1426-2
Difco Agar BD Biosciences 214530
glass beads Fisher Scientific 10-310-1
QFill3 Genetix X3050
Bleach Javex
Ethanol Sigma-Aldrich E7023
15 mL centrifuge tubes Fisher Scientific 430052
QPix colony picker Genetix QPix2
picking head (E. coli) Genetix X4006

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Zaikova, E., Hawley, A., Walsh, D. A., Hallam, S. J. Seawater sampling and. J Vis Exp. (2009).
  2. Walsh, D. A., Zaikova, E., Hallam, S. J. Large volume (20L+) filtration of coastal seawater samples. J Vis Exp. 28, (2009).
  3. Wright, J. J., Lee, S., Zaikova, E., Walsh, D. A., Hallam, S. J. DNA Extraction from 0.22 μM Sterivex Filters and Cesium Chloride Density Gradient Centrifugation. J Vis Exp. 31, 10-3791 (2009).
  4. Stein, J. L., Marsh, T. L., Wu, K. Y., Shizuya, H., DeLong, E. F. Characterization of uncultivated prokaryotes: isolation and analysis of a 40-kilobase-pair genome fragment from a planktonic marine archaeon. J. Bacteriol. 178, 591-599 (1996).
  5. Béjà, O., Suzuki, O., Koonin, M. T., Aravind, E. V., Hadd, L., Nguyen, L. P. A., Villacorta, R., Amjadi, M., Garrigues, C., Jovanovich, S. B., Feldman, R. A., DeLong, E. F. Construction and analysis of bacterial artificial chromosome libraries from a marine microbial assemblage. Environ. Microbiol. 2, 516-529 (2000).
  6. DeLong, E. F., Preston, C. M., Mincer, T., Rich, V., Hallam, S. J., Frigaard, N. -U., Martinez, A., Sullivan, M. B., Edwards, R., Brito, B. R., Chisholm, S. W., Karl, D. M. Community genomics among stratified microbial assemblages in the Ocean's interior. Science. 311, 496-503 (2006).
  7. Hallam, S. J., Putnam, N., Preston, C. M., Detter, J. C., Rokhsar, D., Richardson, P. M., DeLong, E. F. Reverse methanogenesis: testing the hypothesis with environmental genomics. Science. 305, 1457-1462 (2004).

Comments

3 Comments

  1. Awesome and very detailed protocol. I like it!

    Reply
    Posted by: Anonymous
    November 26, 2009 - 8:04 PM
  2. Dear Dr. Hallan,
    I am a researcher working at the Environmental Microbiology Laboratory in the National Patagonian Research Center, Argentina. We are just about to start with the preparation of a metagenomic fosmid library from marine sediments, using Epicentre Copy Control kit. We tried the protocol exactly as the manufacturer suggests, performing only ligation and packaging controls before we start with our DNA. Our packaging efficiency was about 10 e 8, but no colonies appeared in the ligation control reaction. I read your JoVE paper, and as your protocol dŒs not involve so much dilution as Epicentre dŒs (they recommend diluting the lambda packages to 1 ml and then the plating dilution again 1:1000), we suspected some kind of problem.
    Have you performed the titering of a ligation control in your conditions? we would like to know the titer and efficiency if you have got this data, as it would greatly help us in our next steps (we want to try the control ligation in your conditions).
    thanks in advance for your time,
    sincerely
    Mariana Lozada

    Reply
    Posted by: Anonymous
    April 9, 2010 - 10:05 PM
  3. I enjoyed your protocol, as it was good to see a demonstration of Epicentre's long fosmid cloning protocol. However, the video says that for colony picking you fill the plate with LB + chloramphenicol + 10% glycerol, but the text says ²0%. Having printed out the protocol and generating our own pCC1FOS, we proceeded to pick ~1000 colonies by hand and transferred them to 96 well plates containing LB + 1².5 µg/ml chloramphenicol + ²0% glycerol. You can imagine the level of disappointment when we pulled the plates out of the 37 degree C room after ²4 hours with absolutely no growth in any of the wells. I just hope that this dŒs not happen to anybody else.

    Reply
    Posted by: Anonymous
    November 20, 2011 - 12:25 AM

Post a Question / Comment / Request

You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

Usage Statistics