Большой Вставить экологического производства геномной библиотеки

Biology

Your institution must subscribe to JoVE's Biology section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

Строительство fosmid библиотека с экологическими геномной ДНК, выделенной из вертикального континуума глубины сезонно гипоксических фьорда описано. В результате клон библиотеки собирают в 384-луночных планшетах и ​​архивируются для последующих последовательности и функционального скрининга путем применения автоматизированной системы сбора колонии.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Taupp, M., Lee, S., Hawley, A., Yang, J., Hallam, S. J. Large Insert Environmental Genomic Library Production. J. Vis. Exp. (31), e1387, doi:10.3791/1387 (2009).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Подавляющее большинство микробов в природе в настоящее время остаются недоступными для традиционных методов культивирования. За последние десять лет, культуры, независимых экологических геномной (

Protocol

Fosmid библиотеки строительства был разделен на четыре основных этапа и подразделяется на несколько частей (см. рис.1 для обзора).

Этап I (см. протокол "экстракции ДНК из 0,22 мкм фильтры Sterivex" [3])

Часть 1: фермент-катализируемых лизиса клеток

Часть 2: Очистка экологических ДНК CsCl центрифугирования в градиенте плотности и восстановление ДНК

Часть 3: Контроль качества добываемой ДНК с помощью гель-электрофореза

Шаг II

Часть 1: ферментативной модификации шаги восстановления экологического ДНК

Все реагенты, необходимые для окончания ремонта шаг экологические ДНК включены в pCC1 Fosmid Библиотека Производство Kit от ЭПИЦЕНТР. В идеале, геномная ДНК должна быть скорректирована до 0,5 мкг / мкл.

  1. Оттепель все реагенты на льду, объединить следующие и кратко центрифуге трубки, чтобы получить все жидкости на дно:
    • х мкл стерильной воды
    • 8 мкл 10X окончания ремонтно-буфера
    • 8 мкл 2,5 мМ дНТФ смеси
    • 8 мкл 10 мМ ATP
    • до 20 мкг стриженой вставки ДНК (~ 0,5 мкг / мкл)
    • 4 мкл окончания ремонтно-ферментом смеси
    • 80 мкл общий реакционный объем
  2. Инкубируйте при комнатной температуре в течение минимального времени за 45 минут до 60 минут и тепловой инактивации фермента смесь при температуре 70 ° С в течение 10 мин (в среднем, подготовьтесь легкоплавких агарозном геле для последующего выбора размера конечного отремонтировали ДНК, см. ниже).

Часть 2: Размер отбор геномной ДНК с помощью импульсного поля гель-электрофореза (PFGE)

  1. Повторное приостановить 1,5 г низкой температурой плавления агарозы в 150 мл 1,0 TAE работает буфер и добавить небольшой магнитной мешалкой. Обложка колбу с микроволновой печи полиэтиленовой пленкой и варить быстро в микроволновой печи до агарозном полностью не растворится. Перемешать раствор, пока не будет достаточно холодно, чтобы влить в гель лоток (~ 60 ° C).
    Примечание: не включайте этидия бромид или SYBR Золотой либо в гель или в управлении буфером.
  2. Соберите гель лоток отдать свой гель и выбрать расческу, которая даст вам достаточно места, чтобы загрузить полный конец ремонтно-смесь в одной или двух скважин (80 мкл плюс соответствующее количество загрузки буфера).
  3. Залить 2,2 л 1,0 TAE на электрофорез камеру и включите машину распространить работает буфер и установить устройство охлаждения до 14 ° C. Насос должен работать на 70 оборотов в минуту, чтобы обеспечить достаточную циркуляцию работает буфера и сохранить буфера при 14 ° C.
  4. Залить расплавленный агарозном геле в лоток на хорошо выровнять поверхность как только он охлаждается и убедитесь, что вам избежать пузырей. Обеспечить расплавленного агарозном даже на геле гребень, в противном случае удалить расческу и положил его обратно в расплавленной агарозы. Как только гель затвердевает, удалите гребень и нагрузки СЧ я PFG маркер в четвертом и геля. Extrude агарозном гель от шприца и нарезать небольшой плагин с конца с помощью скальпеля. Место разъем на передней панели хорошо и печать с расплавленной агарозы. Место гель-электрофореза в камере.
    Примечание: обрабатывать ваши агарозном геле очень тщательно, поскольку низкое тормоза плавления гели легко. Проверьте, работает буфер охлаждают до 14 ° C, прежде чем начать загружать ваши геля. Если ваш скважин выглядеть заблокирован агарозы, попробуйте выполнить следующие следующий раз: прежде чем удалить гребень из геля, добавить 1-2 мл ТАЕ-буфер вокруг гребенку, это приведет лучше скважин.
  5. В первой скважины нагрузки 5 мкл λ HindIII переварить затем по 1 мкл fosmid размер маркера управления (ЭПИЦЕНТР, 100 нг / мкл). Добавьте 10 мкл стерильной воды для размера маркера в микроцентрифужных трубки, а также соответствующее количество загрузки буфера. Больший объем, облегчает нагрузку геля. Непосредственно рядом с маркером fosmid загрузить конечных отремонтировано и тепла инактивированной смеси с соответствующим количеством загрузки буфера. Закрыть крышкой и программа настройки.
    Примечание: мы очень рекомендую загрузки различных количеств других лестницы ДНК, чтобы примерно определить количество ДНК или визуализировать степень сдвига вашего геномной ДНК. Идеально маркеры размера λ ДНК-HindIII Digest и СЧ я PFG Маркер (как с НЭБ).
  6. Программа настройки: алгоритм использования Auto, если ваш PFGE система оснащена этим. Программа автоматически рассчитывает параметр, который необходимо отделить ДНК определенного размера диапазона. Настройки используются: ДНК диапазоне размеров 2-250 Кб; калибровочный коэффициент: 1; градиентом: [6 В / см]; время выполнения: 12:00 часов; прилежащий угол: 120 °; начальный момент времени переключения: 0.1 сек; окончательное время переключения : 21,79 сек; наращивает фактор = линейный.
  7. Для визуализации вашей ДНК, залить 250 мл буфера 1,0 TAE в емкость и добавить по 25 мкл 10.000X Золотой SYBR, аккуратно перемешать, прежде чем разместить геля в раствор. Пятно вашего геля в течение 1 ч в темноте, как SYBR Золото светочувствительным.
    Примечание: обращаться с Вашимиgarose гель очень тщательно, поскольку низкое гели плавления тормоз легко.

Часть 3: ДНК-восстановление путем экстракции геля и перевязки восстановленных ДНК fosmid вектор клонирования

Все реагенты для этой части входят в ЭПИЦЕНТР fosmid-библиотека производство комплекта.

  1. В то же время готовить на водяной бане при температуре 70 ° C и один при 45 ° С в течение шаг пищеварения геля.
  2. Возьмите окрашенный гель вместе с пустыми взвешенную трубку микроцентрифужных и стерильным скальпелем синий transilluminator света. Визуализация конечного отремонтировано геномной ДНК и fosmid размер маркера контроля. Акцизный геля с помощью скальпеля, которые мигрировали с и чуть выше положение fosmid размер маркера управления (акцизный геля которых составляет 5-7 мм в ширину) и передачи квант взвешенную трубку микроцентрифужных. Выполнить СЧ я PFG Маркер на гель, поскольку это поможет вам не вырезано гель слишком высока.
    Примечание: лежал полиэтиленовой пленкой на синем transilluminator свет, прежде чем положить ваш гель на нее, чтобы предотвратить перекрестное загрязнение и износ просмотре очки перед включением синего света. Не акцизного ломтиками гель где геномной ДНК меньше fosmid размер маркера контроля, как это приведет к нежелательным химерных клонов.
    Вы можете вырезать и хранить гель ломтиками содержащие ниже или выше молекулярный вес ДНК для построения целого генома дробовика или BAC библиотеки, соответственно.
    Стоп I: восстановленные геля (ы) могут храниться при температуре -20 С на срок до одного года
  3. Взвесьте взвешенную труб и вычислить вес геля (ы). 1 мг агарозы получается примерно 1 мкл расплавленной агарозы.
  4. Растопить низкой температурой плавления агарозы содержащий геномной ДНК в водяной бане при температуре 70 ° С в течение 10-15 минут (мы не добавляем gelase буфера). После геля полностью растаял, передача трубки быстро до 45 ° C.
    Обратите внимание: не вихрь ваш образец, чтобы помочь растворению так как это может сдвига вашей ДНК.
  5. Добавить 1 U (1 мкл) из GELase ферментного препарата на 100 мкл расплавленной агарозы. Инкубировать при 45 ° С в течение 1 часа, а затем добавить еще GELase (2-4 мкл) и инкубировать дополнительный час. Тепло инактивировать GELase ферментного препарата при температуре 70 ° С в течение 10 минут.
    Поместите пробирку на льду в течение 10 мин и центрифуги трубки на максимальной скорости (13 000 оборотов в минуту) в течение 15 мин для осаждения каких-либо нерастворимых частиц. Аккуратно снимите верхнюю супернатант и перенести его на 15 мл трубки Сокол и добавить 3 мл стерильной воды в трубе.
    Примечание: избегайте пипетирования любой гранулированный агарозы. Как мы добавляем больше GELase не включаться в комплект, мы заказываем дополнительную ферментного препарата GELase отдельно.
  6. Передача решение Amicon Ультра-4 центробежного фильтра блок с Ultracel-10 мембраны и спина трубки в 4000 г в течение 6-8 минут и отказаться проходить через. Центрифуга, пока количество раствора на фильтре снижается до примерно 100 ~ 500 мкл. Добавьте еще 3 мл стерильной воды в пустую трубку Сокол сверху и передачи решения Amicon трубку и повторите шаг центрифугирования. Вымойте третий раз с 3 мл воды и отказаться проходить через раз. Сокращение конечного объема до 50 - 100 мкл.
    Обратите внимание: мы используем Бакет ротор для центрифугирования шаг, просто поместите Amicon центробежный фильтр, чтобы в трубке 50 мл Сокол чтобы удерживать его на месте во время центрифугирования. Amicon фильтр благополучно сохраняет 50 мкл раствора на фильтр, даже после длительного центрифугирования.
  7. Передача оставшийся раствор ДНК из Amicon трубки в предварительно вымытые микроконтроллер YM-50 центробежный фильтр группы и промыть Amicon трубы с дополнительными 50 мкл стерильной воды, чтобы восстановить все ДНК. Центрифуга микроконтроллер YM-50 центробежный фильтр группы в микроцентрифужных в 10000 г до фильтра еще чуть-чуть покрыты жидкостью. Проверьте каждую минуту, если только небольшим количеством жидкости остается на фильтре. Включите фильтр с ног на голову и восстановления ДНК решение, второй шаг центрифугированием при 1000 г в течение 3 мин в новую пробирку микроцентрифужных. В результате объем не должен превышать 10-15 мкл в общей сложности, в противном случае ваша ДНК может быть слишком разводят в перевязке шаг.
    Примечание: будьте осторожны, чтобы не спин фильтра устройство для завершения сухости. Если ваша оболочка сухая, добавьте 10-15 мкл воды на мембране, агитировать мягко в течение 30 секунд и восстановления ДНК, как описано выше.
  8. Количественная ваш Полученный раствор ДНК NanoDrop или PicoGreen анализа.
  9. Восстановленные конечных отремонтировано ДНК готов к лигировали pCC1-fosmid клонирования вектор. Оттепель следующее решение по льду и убедиться, что вектор вставить молярное соотношение составляет 10:1.
    Примечание: 0,5 мкг pCC1-fosmid вектор ~ 0,09 пмоль вектор.
    0,25 мкг ~ 40 Kb ДНК-вставки ~ 0,009 пмоль ДНК-вставки
    Увеличение количества ДНК, используемые в перевязке шагом может быть полезно, если вы должны получить только несколько fosmid клонов после покрытия инфицированных E. кишечной клеток наВыбор пластин.

    Добавить реагенты в порядке, ниже и кратко центрифуге трубки, чтобы получить все жидкости на дно, водопроводной трубе и спина еще раз:

    • х мкл стерильной воды
    • 1 мкл 10X Быстро-Link перевязки буфер
    • 1 мкл 10 мМ ATP
    • 1 мкл pCC1-fosmid вектор (0,5 мкг / мкл)
    • х мкл концентрированного ДНК-вставки (0,25 мкг)
    • 1 мкл Быстро-Link ДНК-лигазы
    • 10 мкл общий реакционный объем
  10. Инкубируйте при комнатной температуре в течение 2 часов и тепловой инактивации фермента в течение 10 минут при температуре 70 ° C.
    Стоп II: хранить перевязки смесь при температуре -20 ° С или переходите к шагу упаковки фага.
    Примечание: одной реакции лигирования будет производить 10 3 -10 6 клонов в зависимости от качества экологической ДНК. На основании предполагаемого числа клонов, которые требуются для покрытия частности, можно масштабировать до реакции лигирования. Если перевязка масштабируется вверх, то количество фага экстракт упаковки должны быть расширены, соответственно, как описано ниже.

Шаг III

Часть 1: Фаг-упаковке вектор-вставка перевязки продукт

  1. Два или три дня до предназначена полоса фага из упаковки при условии, EPI300-T1 R покрытия нагрузки на равнине пластины LB и инкубировать в течение ночи при 37 ° С для получения отдельных колоний. Эта плита может быть опломбирована и хранится при температуре 4 ° C для дальнейшего использования.
  2. За день до прививки упаковки реакции 50 мл бульона LB + 10 мМ MgSO 4 (добавить 500 мкл 1М MgSO 4) с одной единственной колонии пластины, полученной на этапе 1. Встряска при 225 оборотах в минуту и ​​37 ° С в течение ночи.
  3. День упаковки реакции прививку свежие 50 мл LB бульоне + 10 мМ MgSO 4 с 5 мл ночной культуры, подготовленный в шаге 2. Рост при 37 ° С до OD 600 от 0,8 до 1,0 и не превышают диаметр 600 из 1.0! Развести ваш образец перед измерением на спектрофотометре, чтобы получить точный результат. Магазин клетки на льду или при температуре 4 ° С до дальнейшего используется.
    Примечание: Прекратить III: культуры можно хранить при температуре 4 ° С в течение 72 ч, при необходимости, однако использование свежего вырос культуры настоятельно рекомендуется.
  4. Оттепель, на льду, MaxPlax Lambda Упаковка экстракты, 1 тюбик для каждой реакции лигирования выполненные ранее. Размораживание займет 10-15 минут. Между тем, места 1,5 мл пробирку на льду, которые будут предварительно охлажденным.
    Примечание: не оставляйте талой фага на льду слишком долго. В противном случае фага эффективности инфекции будет снижаться.
  5. После оттаивания немедленно передать 25 мкл каждой упаковке экстракта второй предварительно охлажденной 1,5 мл трубки микроцентрифужную и место на льду. Вернуться оставшиеся упаковки экстракт - 80 ° C.
    Примечание: не храните упаковку экстракт с сухим льдом или любым другим источником CO 2.
  6. Добавьте 10 мкл реакции лигирования каждому по 25 мкл талой экстрактов на льду. Смешать с помощью пипетки раствор несколько раз, избежать введения пузырьков воздуха. Кратко центрифуги трубы, чтобы получить все жидкости в нижней части трубки, инкубировать упаковки реакции при 30 ° С в течение 90 мин. После 80 мин инкубации оттепели оставшиеся упаковки экстракта на льду.
    Примечание: использовать водяную баню, а не блок для отопления 30 ° С инкубационный шаг.
  7. Через 90 мин упаковке завершения реакции добавить оставшиеся 25 мкл экстракта упаковки каждой реакционной трубки. Инкубируйте реакции для дополнительных 90 мин при 30 ° С. После 90 мин инкубации добавить 100 мкл подготовленного буфера разбавления Фаг в каждой упаковке трубки и аккуратно перемешать.
    Примечание: если ваша эффективность должна быть низкой в конце концов, ваш экстракты фага может быть слишком старым или имели контакт с сухим льдом или любым другим источником CO 2. По нашему опыту, фаг упаковке при комнатной температуре (2 раза 90 мин), а не 30 ° С с последующим окончательным дополнительной инкубации в течение 2 часов при температуре 30 ° C увеличилось количество результате клонов.
  8. Добавьте 5 мкл хлороформа в каждую пробирку и аккуратно перемешать в результате чего общий объем 165 мкл в трубке. Вязкого осадка могут образоваться после того хлороформ, это не будет вмешиваться в библиотеку производства. Однако избежать этого осадка, а также органической фазы хлороформ, когда пипетирования фагов частиц.
    Стоп IV: на данный момент упакованы частицы фага, могут храниться в течение нескольких дней при температуре 4 ° C.
    Примечание: для лучшей эффективности инфекции фага, используя только что упакованные фага.

Часть 2: Заражение библиотеки хост Е. палочки

  1. Добавить упакованы фаг EPI300-T1 R клеток хозяина (OD 600 = 0,8-1,0) в соотношении 400 мкл EPI300-T1 клетки R на каждые 10 мкл фага частиц. Чтобы избежать любых пипетирования хлороформ мы используем 125 мкл упакованы частицы фага и 5 мл подготовленной EPI300-T1 клетки R хоста. Осторожно перемешать, а затем инкубируют при температуре 37 ° С в течение 30 мин.
    Примечание: будьте осторожны, не передавать хлороформа в клетки хозяина при удалении частиц фага из трубки упаковки фага. Если вы не знаете, взять меньше упакованных частиц фага.

Часть 3: Покрытие и titering

  1. Добавить 5-7 стерилизованные стеклянные бусы на четырех небольших LB + 12,5 мкг / мл хлорамфеникола чашки Петри.
  2. Распространение в два раза по 50 мкл и два раза по 10 мкл фага инфицированных EPI300-T1 R клеток на четырех отдельных пластин. Для обеспечения равномерной распространения, добавьте немного бульона LB (~ 50 мкл) для пластин с 10 мкл фага инфицированных клеток. Встряхните пластину горизонтально чтобы равномерно распространено ячеек на пластине. Пусть пластинка высохнуть в течение 15 мин, а затем удалить бисером опрокидыванием планшета.
    Примечание: эти плиты используются для определения числа трансформантов и рассчитать соответствующие разведения необходимо в шаге выбора колонии, чтобы избежать слишком высокой плотности колонии.
  3. Место пластины с ног на голову в 37 ° С инкубатор от 16 до 24 часов до 48 часов, пока образуют колонии. Проверьте пластины после 24 часов, чтобы предотвратить быстро растущих клонов растет в соседа колоний.
  4. Между тем, урожай остаточные клетки слева, оставшихся с 5 мл инфекции путем центрифугирования при 3500 г в течение 10 минут при 4 ° C. Удалите супернатант. Добавьте 1 мл LB / 20% глицерина к трубе. Повторное приостановить осадок клеток и аликвоту ее до 100 мкл в 2 мл криопробирку труб. Немедленно заморозить и хранить при температуре -80 ° C для дальнейшего использования в колонии сбор шаг.
  5. На следующий день, подсчитать количество клонов на тарелки и определить титр. Обязательно укажите правильный коэффициент разбавления для расчета общей суммы fosmid-клонов.
    Обратите внимание: эта процедура порождает между 10000 и 50000 fosmid-клонов в общей сложности, однако в зависимости от качества и чистоты извлеченных экологические ДНК, в диапазоне от 3000 до 80000 fosmid клонов не наблюдается.

Шаг IV

Часть 1: Агар-луночных планшетах и ​​подготовки

  1. Налейте в средствах массовой информации пластин следующим образом; включают 12,5 мкг хлорамфеникола в LB мл:
    • 100x15 мм чашки Петри: 25 мл агара LB
    • 150X15mm Петри: 50 мл LB агар
    • 245X245mm биопроб квадратной пластины: 250 мл агара LB
    Обратите внимание: важно, чтобы вылить на средства массовой информации и ровную поверхность, чтобы сделать глубину агара равномерно по всей пластине. Мы рекомендуем использовать 245х245 мм пластин для fosmid библиотек, поэтому вам не придется обрабатывать множество пластин.
  2. Оттепель ваш глицерина семенного материала, подготовленного fosmid клонов на льду. Распространение сумма подходит для пластин вы хотите использовать на основе ваших рассчитывается титр (подготовка глицерина акции дополнительно концентратов ваши клетки ~ 5 раз). Время инкубации для роста клеток составляет 24 часа при температуре 37 ° C.
    Стоп V: когда колонии образуются, хранения запечатанных пластин агаре при 4 ° С на срок до одного месяца, пока они используются в колонии сбор шаг.
    Примечание: колонии должны быть распространено равномерно, достаточно далеко друг от друга и должны расти примерно на 1 мм в диаметре. Покрытие клетки с помощью стеклянных бус может генерировать хорошее разделение между колониями. На 100x15 мм чашки Петри, как правило, 150 ~ 250 колоний хорошую плотность для максимальной эффективности сбора робота и в течение 22 х 22 см, не более чем 2.000 колонии должны быть получены.
  3. В дни колонии сбора, подготовки 96 или 384 луночных заполнены LB бульоне дополнен 12,5 мкг хлорамфеникола в бульон мл, а также 20% глицерина для библиотеки хранения при температуре -80 ° C. Ну пластин заполнены автоматизированных QFill3 пластины заполнение системы, как описано ниже.
  4. Автоклав 2 набора стеклянных бутылок (500 мл), крышки и силиконовые трубки. Не автоклаве многообразии, включая сборку иглы и фланец. Соберите QFill3 возле пламени горелки Бунзена или в капот, чтобы создавать и поддерживать стерильную среду.
    Примечание: убедитесь, что силиконовые трубки вставляется в щепотку клапана, нажав щепотку клапана активатора и раздвижные трубы полностью на клапан. (Это работает как тормоз для дозирования средне следующей колонке).
  5. Стерилизовать дозирования иглы, пропуская через ~ 50 мл 1% хлорной извести, автоклавного дН 2 O и 80% этанола, по одному на время и место крышку наконечника окно на платформу для сбора отходов решений. После стерилизации изменения в другой набор, состоящий из трубки бутылки, крышки и кремния.
  6. Заполнить бутылку с ~ 300 мл среды. Выполнить достаточно средство, с помощью, чтобы избавиться от оставшихся этанола из стадии очистки. Как только трубка очищается, нагрузка 96/384 луночный планшет на платформе. Нажмите кнопку "Пуск", чтобы заполнить вашу тарелку, и каждая скважина должна быть заполнена на 200 мкл подготовленного бульона LB. Для очистки дозирования иглы, запустить ~ 50 мл 80% этанола до конца.
    Примечание: убедитесь, что ваш луночный планшет имеет метку перед заполнением.

Часть 2: колонии сбор робот установки

  1. Мы используем клон сбор робот QPix2 переменного токаСогласно руководству пользователя с. Пользователи должны быть знакомы обработки их робота и как настроить все, чтобы гарантировать высокий сбор эффективности.
  2. Для создания стерильной среды в районе сбора клон, включите ультрафиолетового излучения в течение 30 минут. В то время как ультрафиолетовый свет включен, подготовить 500 мл 1% хлорной извести, 500 мл стерильного дН 2 O и 500 мл 80% этанола. При УФ-светом отключает заполнить лотки с маркировкой. Всегда залить решений в правильные ярлыки лотки решение. С задней стенки к передней залить 1% гипохлоритом, то автоклавного дН 2 O и 80% этанола в передней панели. Убедитесь, что они полны. Выбор иглы нельзя мыть правильно без достаточного промывочного раствора.
    Примечание: монитор 80% этанола с течением времени. Он испарится, и должен быть пополнен.
  3. После настройки параметров для оптимального выбора, места подготовлены пластинах агар с fosmid клонов и хорошо пластины, между постов в Q-Pix рабочую область. Убедитесь, что вы предприняли все пластины одеяло!
  4. Плиты должны быть плотно прилегает передний правый угол, поэтому он не может двигаться во время сбора. Затем закройте переднюю панель.
    Примечание: Это чрезвычайно важно!
  5. После того как все параметры заданы сбор процедура может начаться. Когда все сбор завершен промойте кисти и лотки с деионизированной водой и установите на скамейке для просушки. Очистка любых разливов, которые могут возникнуть, и протрите внутри Q-Pix с 80% этанола.

Часть 3: Ночь инкубации и хранения библиотеки

  1. Убедитесь, что все пластины глицерина акции помечены, и поместите их в 37 ° C инкубаторе в течение 24 часов. Оставить записку на инкубатор, который содержит дату, количество пластин инкубировали, время инкубации, время для удаления и свои инициалы.
  2. Для длительного хранения, положить выращивали в течение ночи инкубации в морозильной камере -80 ° C.

Представитель Результаты:

Представлен протокол описывает процедуру, как генерировать экологические fosmid библиотеки для захвата генетических содержание микробного сообщества в данной среде обитания. Этот протокол должен создать fosmid библиотека, которая является представителем генетического содержания проб окружающей среды и должны позволить читателю изменить и оптимизировать критические шаги, если количество fosmid клонов, полученный в конце всей процедуры слишком мала.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Процедура описана, как наиболее эффективно генерировать большие вставки fosmid библиотека с геномной ДНК, полученных из прибрежных пробы воды. Вверх по течению геномной ДНК добыча описана в отдельном протоколе [3].

Как fosmid-библиотека производство многоступенчатых процессов, план не менее двух-трех недель в сроки всей процедуры, включая все четыре представлены шаги. Добыча геномной ДНК является наиболее важным шагом, и все вниз по течению шагов полагаться на качество и количество добываемого геномной ДНК, так считают расходы достаточно времени для этого шага и работать аккуратно. Количество и качество контроля над извлечения ДНК является очень важным. Может случиться, что число клонов fosmid низка, особенно если это первая библиотека вы собираетесь сделать. Как fosmid строительство библиотеки само по себе является прямым, неудача в основном связано с недостаточным качеством и / или количество ваших извлечены и очищенной геномной ДНК. Рассмотрим для повторного извлечения геномной ДНК и обратить особое внимание на этапы очистки и ДНК-восстановления, если ваша библиотека строительства не была успешной.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Мне нечего раскрывать.

Acknowledgments

Мы хотели бы поблагодарить Канадский фонд инноваций, знаний британской Колумбии Фонд развития и Национального наукам и инженерным исследованиям Совета (NSERC) Канады за поддержку проводимых исследований на регионах с низким уровнем кислорода в прибрежных и открытых водах океана. М. Т. и С. были поддержаны стипендии ТУЛА основу финансируемого Центром микробного разнообразия и эволюции (CMDE). МТ также получили стипендии от Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Step II
CopyControl™ Fosmid Library Production Kit Epicentre Biotechnologies CCFOS110 sufficient to generate 9-10 fosmid libraries
SeaPlaque Agarose Cambrex 50100
stirring hot plate Corning PC-420D
1.0X TAE running buffer
CHEF Mapper XA pulsed field electrophoresis system including cooling module and variable speed pump Bio-Rad
λ DNA-HindIII Digest New England Biolabs N3012S
MidRange I PFG Marker New England Biolabs N3551S
10,000X SYBR Gold Invitrogen S11494
microwavable plastic wrap Saran premium wrap
Safe Imager transilluminator Invitrogen S37102
GELase Agarose Gel-Digesting Preparation Epicentre Biotechnologies G09100
scalpel Fisher Scientific 08-927-5D
Amicon Ultra-4 Centrifugal Filter Unit with Ultracel-10 membrane EMD Millipore UFC801024
Microcon YM-30 Centrifugal Filter Unit EMD Millipore 42410
nuclease free water Ambion AM9932
Quant-iT PicoGreen dsDNA Assay Kit *2000 assays*# Invitrogen P7589
digital dry block heater VWR international 12621-088
water bath VWR international 14231-854
centrifuge Beckman Coulter Inc. Avanti J-E
centrifuge rotor Beckman Coulter Inc. JA 5.3
table top centrifuge Eppendorf 5415D
microcentrifuge tubes, 1.7 mL, clear Axygen Scientific MCT-175-C
15 mL centrifuge tubes Fisher Scientific 430052
Step III
LB broth Fisher Scientific BP 1426-2
MgSO4 Sigma-Aldrich M2643
phage dilution buffer 10 mM Tris-HCl [pH 8.3], 100 mM NaCl, 10 mM MgCl2
cryogenic vials Fisher Scientific 430488
Step IV
96 well plate with lid Fisher Scientific CS003370(3370)
384 well plate with lid Fisher Scientific 07201157(3680)
Petri dishes 100 O.D. x 15mm H Fisher Scientific 08-757-12
Petri dishes 150 Dia. x 15mmH Fisher Scientific 08-757-14
BD Falcon BioDish XL 245 X 245 mm VWR international CABD351040
glycerol Sigma-Aldrich G5516
chloramphenicol Sigma-Aldrich C0378
LB broth Fisher Scientific BP 1426-2
Difco Agar BD Biosciences 214530
glass beads Fisher Scientific 10-310-1
QFill3 Genetix X3050
Bleach Javex
Ethanol Sigma-Aldrich E7023
15 mL centrifuge tubes Fisher Scientific 430052
QPix colony picker Genetix QPix2
picking head (E. coli) Genetix X4006

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Zaikova, E., Hawley, A., Walsh, D. A., Hallam, S. J. Seawater sampling and. J Vis Exp. (2009).
  2. Walsh, D. A., Zaikova, E., Hallam, S. J. Large volume (20L+) filtration of coastal seawater samples. J Vis Exp. 28, (2009).
  3. Wright, J. J., Lee, S., Zaikova, E., Walsh, D. A., Hallam, S. J. DNA Extraction from 0.22 μM Sterivex Filters and Cesium Chloride Density Gradient Centrifugation. J Vis Exp. 31, 10-3791 (2009).
  4. Stein, J. L., Marsh, T. L., Wu, K. Y., Shizuya, H., DeLong, E. F. Characterization of uncultivated prokaryotes: isolation and analysis of a 40-kilobase-pair genome fragment from a planktonic marine archaeon. J. Bacteriol. 178, 591-599 (1996).
  5. Béjà, O., Suzuki, O., Koonin, M. T., Aravind, E. V., Hadd, L., Nguyen, L. P. A., Villacorta, R., Amjadi, M., Garrigues, C., Jovanovich, S. B., Feldman, R. A., DeLong, E. F. Construction and analysis of bacterial artificial chromosome libraries from a marine microbial assemblage. Environ. Microbiol. 2, 516-529 (2000).
  6. DeLong, E. F., Preston, C. M., Mincer, T., Rich, V., Hallam, S. J., Frigaard, N. -U., Martinez, A., Sullivan, M. B., Edwards, R., Brito, B. R., Chisholm, S. W., Karl, D. M. Community genomics among stratified microbial assemblages in the Ocean's interior. Science. 311, 496-503 (2006).
  7. Hallam, S. J., Putnam, N., Preston, C. M., Detter, J. C., Rokhsar, D., Richardson, P. M., DeLong, E. F. Reverse methanogenesis: testing the hypothesis with environmental genomics. Science. 305, 1457-1462 (2004).

Comments

3 Comments

  1. Awesome and very detailed protocol. I like it!

    Reply
    Posted by: Anonymous
    November 26, 2009 - 8:04 PM
  2. Dear Dr. Hallan,
    I am a researcher working at the Environmental Microbiology Laboratory in the National Patagonian Research Center, Argentina. We are just about to start with the preparation of a metagenomic fosmid library from marine sediments, using Epicentre Copy Control kit. We tried the protocol exactly as the manufacturer suggests, performing only ligation and packaging controls before we start with our DNA. Our packaging efficiency was about 10 e 8, but no colonies appeared in the ligation control reaction. I read your JoVE paper, and as your protocol dŒs not involve so much dilution as Epicentre dŒs (they recommend diluting the lambda packages to 1 ml and then the plating dilution again 1:1000), we suspected some kind of problem.
    Have you performed the titering of a ligation control in your conditions? we would like to know the titer and efficiency if you have got this data, as it would greatly help us in our next steps (we want to try the control ligation in your conditions).
    thanks in advance for your time,
    sincerely
    Mariana Lozada

    Reply
    Posted by: Anonymous
    April 9, 2010 - 10:05 PM
  3. I enjoyed your protocol, as it was good to see a demonstration of Epicentre's long fosmid cloning protocol. However, the video says that for colony picking you fill the plate with LB + chloramphenicol + 10% glycerol, but the text says ²0%. Having printed out the protocol and generating our own pCC1FOS, we proceeded to pick ~1000 colonies by hand and transferred them to 96 well plates containing LB + 1².5 µg/ml chloramphenicol + ²0% glycerol. You can imagine the level of disappointment when we pulled the plates out of the 37 degree C room after ²4 hours with absolutely no growth in any of the wells. I just hope that this dŒs not happen to anybody else.

    Reply
    Posted by: Anonymous
    November 20, 2011 - 12:25 AM

Post a Question / Comment / Request

You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

Usage Statistics