Grandes Inserir Produção Ambiental Biblioteca Genômica

Biology

Your institution must subscribe to JoVE's Biology section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

Welcome!

Enter your email below to get your free 10 minute trial to JoVE!





We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.

If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.

 

Summary

Construção de uma biblioteca fosmid com DNA genômico ambiental isolado do contínuo de profundidade vertical de um fiorde sazonalmente hipóxica é descrito. A biblioteca clone resultante é escolhido em 384 poços pratos e arquivados para seqüenciamento e análise funcional a jusante pela aplicação de um sistema automatizado colônia colheita.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Taupp, M., Lee, S., Hawley, A., Yang, J., Hallam, S. J. Large Insert Environmental Genomic Library Production. J. Vis. Exp. (31), e1387, doi:10.3791/1387 (2009).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

A grande maioria dos micróbios na natureza atualmente permanecem inacessíveis aos métodos tradicionais de cultivo. Durante a última década, a cultura independente de genômica ambiental (

Protocol

Fosmid construção da biblioteca foi dividida em quatro etapas principais e sub-dividido em várias partes (ver Fig.1 para uma visão geral).

Etapa I (ver protocolo de "extração de DNA a partir de 0,22 mM filtros Sterivex" [3])

Parte 1: Enzyme-catalisada lise celular

Parte 2: Purificação de DNA ambiental por centrifugação CsCl gradiente de densidade e recuperação de DNA

Parte 3: Controle de qualidade de DNA extraído por eletroforese em gel

Etapa II

Parte 1: etapas de modificação enzimática de DNA recuperado ambientais

Todos os reagentes necessários para a etapa final de reparo do DNA ambiental estão incluídos no Kit de Produção pCC1 Biblioteca Fosmid de Epicentro. Idealmente, o seu DNA genômico deve ser ajustada para 0,5 mg / mL.

  1. Descongelar todos os reagentes no gelo, combine o seguinte e brevemente o tubo de centrífuga para obter todo o líquido para o fundo:
    • x mL de água estéril
    • 8 mL tampão final de reparo-10X
    • 8 mL 2,5 mM dNTP mix
    • 8 mL 10 mM ATP
    • até 20 mg sheared inserir DNA (~ 0,5 mg / mL)
    • 4 mL da enzima mix final reparo
    • 80 mL de volume total de reação
  2. Incubar a temperatura ambiente por um tempo mínimo de 45 minutos até 60 minutos e calor inativar a enzima mistura a 70 ° C por 10 min (no tempo médio, preparar um ponto de fusão baixo gel agarose para posterior escolha de tamanho de fim-reparado DNA, veja abaixo).

Parte 2: Tamanho-selecção do DNA genômico por eletroforese em campo pulsado gel (PFGE)

  1. Re-suspender de 1,5 g de agarose baixa temperatura de fusão em 150 mL de tampão de corrida TAE 1,0 X e adicionar uma barra de agitação magnética pequena. Cubra o recipiente com filme plástico e deixe ferver rapidamente microwavable no microondas até agarose esteja completamente dissolvido. Mexa até que solução está frio o suficiente para deitar na bandeja de gel (~ 60 ° C).
    Nota: não incluem brometo de etídio ou Gold SYBR quer no gel ou no tampão de corrida.
  2. Montar o tabuleiro de gel para lançar o seu gel e escolher um pente que irá dar-lhe espaço suficiente para carregar o mix final de reparo completo em um minério de dois poços (80 mL valor mais adequado de tampão de carregamento).
  3. Despeje 2,2 L de 1,0 X TAE para a câmara de electroforese e ligar a máquina para circular o tampão de corrida e defina o dispositivo de refrigeração a 14 ° C. A bomba deve ser executado em 70 rpm para garantir a circulação suficiente de tampão de corrida e manter a reserva em 14 ° C.
  4. Despeje a agarose derretida na bandeja de gel em uma superfície bem nivelada, uma vez que é resfriado e certifique-se evitar bolhas. Garantir a agarose fundida é ainda no pente gel, caso contrário, remova o pente e colocá-lo de volta para a agarose derretida. Uma vez que o gel é solidificado, remova o pente e carregar um midrange eu PFG marcador no quarto poço do gel. Extrude agarose da seringa de gel e uma fatia pequena ficha a partir do final com um bisturi. Coloque o plugue na frente do poço e selo com agarose derretida. Coloque o gel dentro da câmara de electroforese.
    Nota: lidar com o seu gel de agarose com muito cuidado tão baixo freio gel derretendo facilmente. Verifique se o tampão de corrida terá arrefecido até 14 ° C antes de começar a carregar o seu gel. Se o seu olhar poços bloqueados por agarose, tente o seguinte tempo seguinte: antes de remover o pente do gel, adicionar 1-2 mL tampão TAE-around o pente, o que irá resultar em poços mais agradável.
  5. No poço de carga primeiros 5 mL de λ HindIII digerir seguido de 1 ml do marcador fosmid controle de tamanho (Epicentro, 100 ng / mL). Adicionar 10 ml de água estéril para o marcador de tamanho em um tubo de microcentrífuga, bem como uma quantidade adequada de tampão de carregamento. Quanto maior o volume torna mais fácil para carregar o gel. Diretamente ao lado do marcador fosmid carregar o seu final de reparado e inativado pelo calor mistura com uma quantidade adequada de tampão de carregamento. Feche a tampa e as configurações do programa.
    Nota: nós realmente recomendamos carregar diferentes quantidades de DNA outras escadas para cerca de quantificar a quantidade de DNA ou para visualizar a extensão do corte do seu DNA genômico. Marcadores de tamanho ideal são λ DNA-HindIII Digest e midrange eu PFG Marker (ambos do NEB).
  6. Programa as configurações: algoritmo Auto use se o seu sistema PFGE é equipado com isso. O programa calcula automaticamente a configuração necessária para separar o DNA de uma gama determinado tamanho. Configurações utilizadas são: faixa de DNA tamanho 2-250 Kb; fator de calibração: 1; gradiente: [6 V / cm]; tempo de execução: tempo de comutação final; 0,1 seg: 12:00 horas;:; ângulo incluído 120 ° Tempo de comutação inicial : 21,79 seg; ramping um fator linear =.
  7. Para visualizar o seu DNA, despeje 250 ml de tampão TAE 1,0 X em um recipiente e adicionar 25 mL de Ouro SYBR 10.000X e misturar delicadamente antes de colocar o gel na solução. Manchar o gel por 1 h no escuro, como SYBR Gold é sensível à luz.
    Nota: lidar com o seu umgarose gel com muito cuidado como géis de fusão baixo freio facilmente.

Parte 3: recuperação de DNA por extracção gel e ligadura de DNA recuperado para o vetor de clonagem fosmid

Todos os reagentes para esta parte estão incluídos no kit de produção Epicentro fosmid-biblioteca.

  1. Nesse meio tempo preparar um banho de água a 70 ° C e uma a 45 ° C para a etapa de digestão gel.
  2. Leve o seu gel corado juntamente com um tubo de microcentrífuga vazio tarado e um bisturi estéril para o transiluminador de luz azul. Visualize o seu fim-reparado DNA genômico eo marcador tamanho fosmid controle. Uma fatia especial sobre o consumo de gel com um bisturi que migraram com e ligeiramente acima da posição do marcador fosmid controle de tamanho (uma fatia especial sobre o consumo de gel que é 5-7 mm de largura) e transferir a fatia para o tubo de microcentrífuga tarado. Executar um midrange eu PFG marcador no seu gel, pois isso ajuda você a não cortar o gel muito alto.
    Nota: colocar plástico no transiluminador de luz azul antes de colocar o seu gel sobre ele para evitar a contaminação cruzada e usar os óculos de visualização antes de ligar a luz azul. Não fatias gel especial de consumo, onde o DNA genômico é menor do que o marcador fosmid controle de tamanho, pois isso resultará em indesejada clones quiméricos.
    Você pode cortar e armazenar fatias de gel contendo DNA de peso inferior ou superior molecular para a construção de shotgun genoma inteiro ou bibliotecas BAC, respectivamente.
    Parar I: a fatia de gel recuperado (s) podem ser armazenadas a -20 ° C por até um ano
  3. Pesar os tubos de tarado e calcular o peso da fatia de gel (s). 1 mg de agarose renderá cerca de 1 ml de agarose derretida.
  4. Derreta a baixa temperatura de fusão agarose contendo o DNA genômico em banho-maria a 70 ° C por 10-15 minutos (não adicionar tampão gelase). Depois de sua fatia gel é completamente derretido, transfira o tubo rapidamente para 45 ° C.
    Nota: não vortex sua amostra para ajudar na dissolução pois isso pode cisalhamento seu DNA.
  5. Adicione 1 U (1μl) de preparação enzimática GELase por 100 l de agarose derretida. Incubar a 45 ° C por 1 hora e depois adicionar mais GELase (2-4 mL) e incubar por uma hora adicional. Calor inativar a preparação enzimática GELase a 70 ° C por 10 minutos.
    Colocar o tubo em gelo por 10 min e centrifugar o tubo na velocidade máxima (13.000 rpm) por 15 min a pelota quaisquer partículas insolúveis. Remova cuidadosamente o sobrenadante superior e transferir para um tubo Falcon 15 mL e adicionar 3 mL de água estéril ao tubo.
    Nota: evitar pipetar qualquer agarose peletizada. À medida que adicionar mais do que GELase incluído no kit, que fim preparação enzimática extras GELase separadamente.
  6. Transferir a solução para um Ultra-4 Amicon Unidade Centrífuga de filtro com membrana Ultracel-10 e girar o tubo a 4.000 g por 6-8 minutos e descartar a fluir. Centrifugar até que a quantidade de solução no filtro é reduzida a cerca de 100 ~ 500 mL. Adicionar outro de 3 mL de água estéril ao tubo Falcon vazio de cima e transferir a solução para o tubo Amicon e repita os passos de centrifugação. Lavar uma terceira vez com 3 mL de água e descarte fluir através de novo. Reduzir o volume final a 50 - 100 ul.
    Nota: usamos um rotor de caçamba móvel para a etapa de centrifugação, basta colocar o Amicon unidade centrífuga de filtro em um tubo Falcon 50 mL para mantê-lo no lugar durante a centrifugação. Amicon filtro retém com segurança 50 ml de solução no filtro, mesmo após a centrifugação prolongada.
  7. Transferir a solução DNA restante do tubo Amicon em um microcontrolador pré-lavada YM-50 Unidade Centrífuga Filtrar e lavar o tubo Amicon com um adicional de 50 mL de água estéril para recuperar todo o DNA. Centrifugar o microcontrolador YM-50 Unidade de centrífuga de filtro em uma microcentrífuga a 10.000 g até que o filtro ainda é ligeiramente cobertos com o líquido. Verifique a cada minuto, se apenas uma pequena quantidade de líquido que resta no filtro. Vire o filtro para baixo e recuperar a sua solução de DNA por uma etapa de centrifugação segundo em 1000 g por 3 min em um tubo de microcentrífuga fresco. O volume resultante não deve exceder 10-15 mL no total, caso contrário o seu DNA pode ser muito diluída na etapa de ligadura.
    Nota: tome cuidado para não girar o seu dispositivo de filtro à secura total. Se a sua membrana é seca, em seguida, adicione 10-15 mL de água sobre a membrana, agitar suavemente durante 30 segundos e recuperar seu DNA como descrito acima.
  8. Quantificar a sua solução de DNA resultante da NanoDrop ou ensaio PicoGreen.
  9. Recuperou-end DNA reparado agora está pronto para ser ligado ao vetor de clonagem pCC1-fosmid. Descongele a seguinte solução no gelo e certifique-se o vetor para inserir razão molar é de 10:1.
    Nota: 0,5 mg pCC1-fosmid vector ~ 0,09 pmoles.
    0,25 mg de ~ 40 Kb inserir DNA ~ 0,009 pmoles inserir DNA
    Aumentar a quantidade de DNA utilizada na etapa ligadura pode ser útil se você deve obter apenas alguns clones fosmid após o plaqueamento infectados E. células coli emplacas de seleção.

    Adicionar os reagentes na ordem abaixo e brevemente o tubo de centrífuga para obter todo o líquido até o fundo, toque no tubo e girar novamente:

    • x mL de água estéril
    • Um buffer de ligadura mL 10X Fast Link-
    • 1 ml 10 mM ATP
    • Um vector pCC1-fosmid mL (0,5 mg / mL)
    • x DNA inserir mL concentrada (0,25 mg)
    • Uma ligase DNA mL Fast Link-
    • 10 mL de volume total de reação
  10. Incubar à temperatura ambiente por 2 horas e calor inativar a enzima por 10 minutos a 70 ° C.
    Parar II: Loja de ligadura mistura a -20 ° C ou avançar para a etapa de embalagem fago.
    Nota: A reação ligadura única produzirá 10 3 -10 6 clones, dependendo da qualidade do DNA ambiental. Com base na estimativa do número de clones que é necessário para a cobertura especial, você pode escalar a reação ligadura. Se a ligação é escalado para cima, então a quantidade de extrato de embalagem fago devem ser ampliados de acordo como descrito abaixo.

Etapa III

Parte 1: Phage embalagem de vetor de inserção de produtos ligadura

  1. Dois ou três dias antes da raia embalagem destinada fago out, desde EPI300-T1 tensão plating R em um prato simples LB e incubar durante a noite a 37 ° C para obter colónias isoladas. Esta placa pode ser selado e armazenado a 4 ° C para uso futuro.
  2. O dia antes da reação de embalagens inocular 50 mL de caldo LB + 10 mM MgSO 4 (adicionar 500 mL 1M MgSO 4) com uma única colônia da placa gerado na etapa 1. Agite a 225 rpm e 37 ° C durante a noite.
  3. O dia das reações embalagem inocular caldo LB fresco 50 mL + 10 mM MgSO 4, com 5 mL da cultura durante a noite preparada na etapa 2. Crescer a 37 ° C para um OD 600 de 0,8 a 1,0 e não exceda 600 OD de 1,0! Diluir a amostra antes da medição no espectrofotômetro para que você obtenha um resultado preciso. Células loja no gelo ou a 4 ° C até mais utilizados.
    Nota: Parar III: a cultura pode ser armazenado a 4 ° C por até 72 horas se necessário, no entanto, utilizando uma cultura fresca crescido é altamente recomendado.
  4. Thaw, no gelo, o MaxPlax Extractos Embalagem Lambda, um tubo para cada reação ligadura realizada anteriormente. Descongelamento terá 10-15 minutos. Enquanto isso, coloque 1,5 mL de tubo no gelo para ser pré-refrigerados.
    Nota: não deixe fago descongeladas no gelo por muito tempo. Caso contrário eficiência de infecção do fago vai cair.
  5. Uma vez descongeladas imediatamente transferir 25 mL de cada extrato de embalagem para um segundo pré-refrigerados microtubo de 1,5 mL e colocar no gelo. Extrato de retorno de embalagens restantes para - 80 ° C.
    Nota: não guardar o extracto de embalagem com gelo seco ou qualquer outra fonte de CO 2.
  6. Adicionar 10 ml da reação de ligação a cada 25 mL dos extratos descongeladas no gelo. Mix pipetando a solução várias vezes, evitar a introdução de bolhas de ar. Brevemente os tubos de centrífuga para obter todo o líquido até o fundo do tubo e incubar as reações de embalagens, a 30 ° C por 90 min. Após 80 min de incubação descongelar restantes extrair embalagem no gelo.
    Nota: use um banho de água ao invés de bloco de aquecimento para os 30 ° C passo de incubação.
  7. Após 90 min de reação embalagem está completa adicione o restantes 25 mL de extrato de embalagem para cada tubo de reacção. Reações incubar por 90 minutos adicionais a 30 ° C. Após 90 min de incubação adicionar 100 l do tampão preparado Phage diluição em cada tubo de embalagem e misture delicadamente.
    Nota: se a sua eficiência deve ser baixa, no final, extratos de sua fago pode ser velho demais ou ter sido exposto ao gelo seco ou qualquer outra fonte de CO 2. Em nossa experiência, embalagem fago à temperatura ambiente (2 vezes 90 min) em vez de 30 ° C seguido por uma incubação final adicionais por 2 horas a 30 ° C aumentou a quantidade de clones resultantes.
  8. Adicionar 5 mL de clorofórmio para cada tubo e misture delicadamente resultando em um volume total de 165 mL no tubo. Um precipitado viscosa pode formar após a adição do clorofórmio, o que não irá interferir com a produção de biblioteca. No entanto evitar esse precipitado, assim como a fase clorofórmica orgânica ao pipetar as partículas phage.
    Parar IV: neste momento as partículas phage embalados podem ser armazenadas por vários dias a 4 ° C.
    Nota: para a melhor eficiência de infecção do fago, use fago recém-embalados.

Parte 2: A infecção do hospedeiro biblioteca E. coli

  1. Adicionar fago embalado para EPI300-T1 células hospedeiras R (OD 600 = 0,8-1,0) na proporção de 400 mL de células EPI300-T1 R mL para cada 10 das partículas phage. Para evitar qualquer pipetagem clorofórmio usamos 125 mL das partículas phage embalados e 5 mL de preparados EPI300-T1 células hospedeiras R. Misture delicadamente e incubar a 37 ° C por 30 min.
    Nota: tome cuidado para não transferir clorofórmio para as células hospedeiras quando você remove as partículas phage do tubo de embalagem fago. Se você não tiver certeza, demorar menos das partículas phage embalados.

Parte 3: Galvanização e titulação

  1. Adicionar 5-7 gotas de vidro esterilizado em quatro pequenos LB + 12,5 mg / mL cloranfenicol pratos petri.
  2. Espalhe duas vezes 50 ul e duas vezes 10 ml do fago células infectadas EPI300-T1 R em quatro pratos separados. Para garantir um espalhamento uniforme, adicione um pouco de caldo LB (~ mL 50) para as placas com o mL 10 de fago células infectadas. Agite a placa horizontalmente para espalhar uniformemente as células na placa. Deixe a placa secar por 15 min e retire as contas invertendo a placa.
    Nota: estas placas são usadas para determinar o número de transformantes e calcular as diluições apropriadas necessárias na etapa de colheita para evitar a colônia colônia densidade muito alta.
  3. Coloque as placas de cabeça para baixo em uma incubadora de 37 ° C por 16 a 24 horas até 48 horas, até formar colónias. Verifique placas após 24 horas para evitar clones rápido crescimento de crescer em colônias vizinho.
  4. Enquanto isso, a colheita das células residuais da esquerda ao longo da infecção de 5 mL por centrifugação a 3.500 g por 10 minutos a 4 ° C. Desprezar o sobrenadante. Adicionar 1 mL LB / glicerol 20% para o tubo. Re-suspender o pellet celular mL e alíquotas para cada 100 mL em 2 tubos cryovial. Congelar imediatamente e armazenar a -80 ° C para posterior utilização na colônia picking passo.
  5. No dia seguinte, contar o número de clones nas placas e determinar o título. Certifique-se incluir o fator de diluição correta para calcular a quantidade total de fosmid-clones.
    Nota: este procedimento gera entre 10.000 e 50.000 fosmid-clones, no total, no entanto, dependendo da qualidade e pureza do DNA extraído do ambiente, um intervalo entre 3.000 até 80.000 clones fosmid é observado.

Etapa IV

Parte 1: Agar e bem preparado placas

  1. Despeje mídia em placas como se segue; incluem 12,5 mg de cloranfenicol por LB mL:
    • 100X15mm petri prato: agar LB 25mL
    • 150X15mm petri prato: 50 ml de agar LB
    • Placa bioensaio 245X245mm quadrado: agar LB 250mL
    Nota: é importante para derramar a mídia sobre uma superfície bem nivelada para que a profundidade do ágar uniformemente ao longo da placa. Recomendamos o uso de placas de 245X245 mm para bibliotecas fosmid para que você não tem que lidar com muitos pratos.
  2. Descongelar o seu estoque de glicerol contendo os clones preparado fosmid no gelo. Espalhe a quantidade adequada para a placa que deseja usar com base no seu título calculado (preparando o estoque de glicerol, adicionalmente, concentra suas células ~ 5 vezes). Tempo de incubação para o crescimento celular é de 24 horas a 37 ° C.
    Parar V: quando colônias formadas, armazenar placas de ágar selada a 4 ° C por até um mês até que eles são usados ​​na etapa de colônia de colheita.
    Nota: as colônias precisam ser distribuídos de maneira equilibrada, bastante distantes uns dos outros e deve crescer cerca de 1 mm de diâmetro. Cultivo de células usando pérolas de vidro pode gerar uma boa separação entre as colônias. Numa placa de Petri 100X15mm, normalmente 150 ~ 250 colônias são uma boa densidade para maior eficiência robô escolhendo e por 22 x 22 cm, não mais do que 2.000 colônias deve ser obtida.
  3. Nos dias de escolher colônia, prepare 96 ou 384 pratos bem cheia de caldo LB suplementado com cloranfenicol 12,5 mg por mL de caldo, assim como 20% de glicerol para armazenamento de biblioteca a -80 ° C. Bem placas são preenchidos com o sistema automático de placas QFill3 enchimento conforme descrito abaixo.
  4. Autoclave 2 conjuntos de garrafas de vidro (500 mL), tampas e tubos de silicone. Não múltiplas autoclave, incluindo a montagem de agulha e flange de montagem. Montar QFill3 perto de uma chama bico de Bunsen ou dentro de um capuz para criar e manter um ambiente estéril.
    Nota: certifique-se que o tubo de silicone é inserida na válvula de restrição pressionando o aperto da válvula ativador e deslizando o tubo completamente na válvula. (Isso funciona como um freio para a dispensa de médio para a próxima coluna).
  5. Esterilizar agulhas de dispensação, passando por ~ 50 mL de água sanitária 1%, autoclavado dH 2 O e etanol 80%, um de cada vez e coloque uma tampa de caixa de ponta na plataforma para coletar soluções de resíduos. Após a esterilização, mude para o outro conjunto que consiste em tubos de tampa de garrafa, e silício.
  6. Preencha frasco com 300 ml ~ médio. Executar o suficiente meio através de se livrar de qualquer etanol restante da etapa de limpeza. Uma vez que a tubulação é limpa, coloque uma placa 96/384 bem na plataforma. Pressione o botão "start" para encher o seu prato, cada poço deve ser preenchido com 200 mL de caldo LB preparado. Para limpar agulhas de dispensação, execute ~ 50 mL de etanol 80% completamente.
    Nota: certifique-se de seu prato bem é marcado antes do enchimento.

Parte 2: colônia de configuração do robô escolhendo

  1. Estamos usando o clone escolher robô QPix2 according o manual do usuário s. Os usuários devem estar familiarizados manipulação de seu robô e como configurar tudo para garantir maior eficiência de colheita.
  2. Para criar um ambiente estéril ao redor da área de separação clone, ligar a luz UV por 30 minutos. Enquanto a luz UV é de, preparar 500 mL de água sanitária 1%, 500 ml de dH 2 O estéril e 500 mL de etanol a 80%. Quando a luz UV desliga encher as bandejas como rotulados. Sempre derramar as soluções nas bandejas de solução corretamente rotulados. De trás para a frente preencher bleach 1%, em seguida, autoclavado dH 2 O e 80% de etanol na bandeja da frente. Certifique-se que eles estão cheios. Agulhas escolher não pode ser lavado adequadamente sem solução de lavagem suficiente.
    Nota: etanol monitor de 80% ao longo do tempo. Vai evaporar e precisa ser complementado.
  3. Depois de configurar os parâmetros para escolher melhor, coloque as placas de ágar preparado com clones fosmid e placas bem entre os postes na área de trabalho Q-Pix. Certifique-se de ter tomado todas as capas placa off!
  4. As placas devem ser apertados contra canto frontal direito, por isso não podem se mover durante a colheita. Em seguida, feche o painel frontal.
    Nota: Isto é extremamente importante!
  5. Uma vez que todos os parâmetros são definidos o procedimento de colheita pode começar. Quando todos picking é completado lavar os pincéis e bandejas com água deionizada e definir sobre a bancada para secar. Limpar todos os derramamentos que possam ter ocorrido, e limpar o interior do Q-Pix com etanol 80%.

Parte 3: incubação Overnight e armazenamento biblioteca

  1. Assegurar que todas as placas de ações glicerol são rotulados, e colocá-los na incubadora a 37 ° C por 24 horas. Deixar uma nota sobre a incubadora que contém a data, número de placas incubadas, o tempo de incubação, tempo para remoção e suas iniciais.
  2. Para o armazenamento de longo tempo, coloque as incubações crescido durante a noite em um freezer -80 C °.

Resultados representativos:

O protocolo apresentado descreve o procedimento de como gerar uma biblioteca ambiental fosmid para capturar o conteúdo genético de uma comunidade microbiana em um determinado habitat. Este protocolo deve criar uma biblioteca fosmid que é representante para o conteúdo genético do ambiente amostrado e deve permitir que o leitor a modificar e otimizar as etapas críticas se a quantidade de clones fosmid obtido no final de todo o processo é muito baixo.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Um procedimento é descrito como mais eficiente gerar uma grande biblioteca a inserir fosmid com DNA genômico derivado de uma amostra de água costeiras. A montante extração do DNA genômico é descrito em um protocolo separado [3].

Como a produção fosmid-biblioteca é um processo de várias etapas, plano de pelo menos duas a três semanas a tempo para todo o procedimento, incluindo todos os passos quatro apresentaram. A extração de DNA genômico é o passo mais crucial e todos os fluxos de down-passos dependem da qualidade e quantidade de DNA genômico extraído; por isso considero passando tempo suficiente para este passo e trabalhar com cuidado. Qualidade e controle da quantidade de seu DNA extraído é muito importante. Pode acontecer que o número de clones fosmid é baixa, especialmente se esta é a primeira biblioteca que você vai fazer. Como a construção da biblioteca fosmid por si só, é para a frente, a falha é causada principalmente pela qualidade insuficiente e / ou quantidade de seu DNA extraído e purificado genômica. Considerar para re-extrair o DNA genômico e prestar atenção especial para as etapas envolvidas na purificação e recuperação de DNA-se a sua construção da biblioteca não foi bem sucedida.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Não tenho nada a revelar.

Acknowledgments

Gostaríamos de agradecer à Fundação Canadense para Inovação, a British Columbia Fundo de Desenvolvimento do Conhecimento e das Ciências e Pesquisa de Engenharia National Council (NSERC) do Canadá para apoiar estudos em andamento em regiões de baixo oxigênio das águas oceânicas costeiras e aberto. MT e SL foram apoiados por bolsas de estudo do Centro de fundação TULA financiado pela Diversidade Microbiana e Evolution (CMDE). MT também recebeu apoio bolsa da Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Step II
CopyControl™ Fosmid Library Production Kit Epicentre Biotechnologies CCFOS110 sufficient to generate 9-10 fosmid libraries
SeaPlaque Agarose Cambrex 50100
stirring hot plate Corning PC-420D
1.0X TAE running buffer
CHEF Mapper XA pulsed field electrophoresis system including cooling module and variable speed pump Bio-Rad
λ DNA-HindIII Digest New England Biolabs N3012S
MidRange I PFG Marker New England Biolabs N3551S
10,000X SYBR Gold Invitrogen S11494
microwavable plastic wrap Saran premium wrap
Safe Imager transilluminator Invitrogen S37102
GELase Agarose Gel-Digesting Preparation Epicentre Biotechnologies G09100
scalpel Fisher Scientific 08-927-5D
Amicon Ultra-4 Centrifugal Filter Unit with Ultracel-10 membrane EMD Millipore UFC801024
Microcon YM-30 Centrifugal Filter Unit EMD Millipore 42410
nuclease free water Ambion AM9932
Quant-iT PicoGreen dsDNA Assay Kit *2000 assays*# Invitrogen P7589
digital dry block heater VWR international 12621-088
water bath VWR international 14231-854
centrifuge Beckman Coulter Inc. Avanti J-E
centrifuge rotor Beckman Coulter Inc. JA 5.3
table top centrifuge Eppendorf 5415D
microcentrifuge tubes, 1.7 mL, clear Axygen Scientific MCT-175-C
15 mL centrifuge tubes Fisher Scientific 430052
Step III
LB broth Fisher Scientific BP 1426-2
MgSO4 Sigma-Aldrich M2643
phage dilution buffer 10 mM Tris-HCl [pH 8.3], 100 mM NaCl, 10 mM MgCl2
cryogenic vials Fisher Scientific 430488
Step IV
96 well plate with lid Fisher Scientific CS003370(3370)
384 well plate with lid Fisher Scientific 07201157(3680)
Petri dishes 100 O.D. x 15mm H Fisher Scientific 08-757-12
Petri dishes 150 Dia. x 15mmH Fisher Scientific 08-757-14
BD Falcon BioDish XL 245 X 245 mm VWR international CABD351040
glycerol Sigma-Aldrich G5516
chloramphenicol Sigma-Aldrich C0378
LB broth Fisher Scientific BP 1426-2
Difco Agar BD Biosciences 214530
glass beads Fisher Scientific 10-310-1
QFill3 Genetix X3050
Bleach Javex
Ethanol Sigma-Aldrich E7023
15 mL centrifuge tubes Fisher Scientific 430052
QPix colony picker Genetix QPix2
picking head (E. coli) Genetix X4006

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Zaikova, E., Hawley, A., Walsh, D. A., Hallam, S. J. Seawater sampling and. J Vis Exp. (2009).
  2. Walsh, D. A., Zaikova, E., Hallam, S. J. Large volume (20L+) filtration of coastal seawater samples. J Vis Exp. 28, (2009).
  3. Wright, J. J., Lee, S., Zaikova, E., Walsh, D. A., Hallam, S. J. DNA Extraction from 0.22 μM Sterivex Filters and Cesium Chloride Density Gradient Centrifugation. J Vis Exp. 31, 10-3791 (2009).
  4. Stein, J. L., Marsh, T. L., Wu, K. Y., Shizuya, H., DeLong, E. F. Characterization of uncultivated prokaryotes: isolation and analysis of a 40-kilobase-pair genome fragment from a planktonic marine archaeon. J. Bacteriol. 178, 591-599 (1996).
  5. Béjà, O., Suzuki, O., Koonin, M. T., Aravind, E. V., Hadd, L., Nguyen, L. P. A., Villacorta, R., Amjadi, M., Garrigues, C., Jovanovich, S. B., Feldman, R. A., DeLong, E. F. Construction and analysis of bacterial artificial chromosome libraries from a marine microbial assemblage. Environ. Microbiol. 2, 516-529 (2000).
  6. DeLong, E. F., Preston, C. M., Mincer, T., Rich, V., Hallam, S. J., Frigaard, N. -U., Martinez, A., Sullivan, M. B., Edwards, R., Brito, B. R., Chisholm, S. W., Karl, D. M. Community genomics among stratified microbial assemblages in the Ocean's interior. Science. 311, 496-503 (2006).
  7. Hallam, S. J., Putnam, N., Preston, C. M., Detter, J. C., Rokhsar, D., Richardson, P. M., DeLong, E. F. Reverse methanogenesis: testing the hypothesis with environmental genomics. Science. 305, 1457-1462 (2004).

Comments

3 Comments

  1. Awesome and very detailed protocol. I like it!

    Reply
    Posted by: Anonymous
    November 26, 2009 - 8:04 PM
  2. Dear Dr. Hallan,
    I am a researcher working at the Environmental Microbiology Laboratory in the National Patagonian Research Center, Argentina. We are just about to start with the preparation of a metagenomic fosmid library from marine sediments, using Epicentre Copy Control kit. We tried the protocol exactly as the manufacturer suggests, performing only ligation and packaging controls before we start with our DNA. Our packaging efficiency was about 10 e 8, but no colonies appeared in the ligation control reaction. I read your JoVE paper, and as your protocol dŒs not involve so much dilution as Epicentre dŒs (they recommend diluting the lambda packages to 1 ml and then the plating dilution again 1:1000), we suspected some kind of problem.
    Have you performed the titering of a ligation control in your conditions? we would like to know the titer and efficiency if you have got this data, as it would greatly help us in our next steps (we want to try the control ligation in your conditions).
    thanks in advance for your time,
    sincerely
    Mariana Lozada

    Reply
    Posted by: Anonymous
    April 9, 2010 - 10:05 PM
  3. I enjoyed your protocol, as it was good to see a demonstration of Epicentre's long fosmid cloning protocol. However, the video says that for colony picking you fill the plate with LB + chloramphenicol + 10% glycerol, but the text says ²0%. Having printed out the protocol and generating our own pCC1FOS, we proceeded to pick ~1000 colonies by hand and transferred them to 96 well plates containing LB + 1².5 µg/ml chloramphenicol + ²0% glycerol. You can imagine the level of disappointment when we pulled the plates out of the 37 degree C room after ²4 hours with absolutely no growth in any of the wells. I just hope that this dŒs not happen to anybody else.

    Reply
    Posted by: Anonymous
    November 20, 2011 - 12:25 AM

Post a Question / Comment / Request

You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

Usage Statistics