संस्कृति और मानव भ्रूण स्टेम कोशिकाओं के रखरखाव

Biology
 

Summary

इस प्रोटोकॉल दर्शाता है कि कैसे बनाए रखने के लिए स्वस्थ, undifferentiated मानव भ्रूण स्टेम कोशिकाओं (ते).

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Kent, L. Culture and Maintenance of Human Embryonic Stem Cells . J. Vis. Exp. (34), e1427, doi:10.3791/1427 (2009).

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Abstract

मानव भ्रूण स्टेम कोशिकाओं (HES) और निगरानी की जानी चाहिए क्रम में स्वस्थ, undifferentiated संस्कृतियों को बनाए रखने के लिए परवाह. कम से कम, संस्कृतियों हर दिन खो पोषक तत्वों की भरपाई के लिए और अवांछित भेदभाव कारकों के मुक्त संस्कृतियों रखने के लिए एक पूरा मध्यम परिवर्तन प्रदर्शन द्वारा खिलाया चाहिए. हालांकि भेदभाव की एक छोटी राशि स्टेम सेल संस्कृतियों में सामान्य और उम्मीद है, संस्कृति नियमित रूप से मैन्युअल रूप से हटाने, या "उठा" विभेदित क्षेत्रों द्वारा किया जाना चाहिए साफ है. पहचान और HES सेल संस्कृतियों से अधिक भेदभाव हटाने कक्षों की एक स्वस्थ आबादी के रखरखाव में आवश्यक तकनीकों हैं.

Protocol

1. रखरखाव: माइक्रोस्कोप के तहत अवलोकन संस्कृति

  1. 37 ° सी इनक्यूबेटर से HES कोशिकाओं के एक थाली निकालें और माइक्रोस्कोप को लाने के.
  2. कम शक्ति पर कालोनियों का निरीक्षण, 2X या 5X बढ़ाई का उपयोग करने के लिए समग्र संस्कृति की गुणवत्ता का आकलन. नोट निम्नलिखित: सामान्य मध्यम रंग, किसी भी दृश्य संदूषण, समग्र कॉलोनी आकार, गुणवत्ता और घनत्व के अभाव, और किसी भी अन्य टिप्पणियों.
  3. मध्यम रंग परिवर्तन निरीक्षण. पीएच में परिवर्तन और HES कोशिकाओं के साथ एक रात ऊष्मायन के बाद मध्यम में पोषक तत्वों की कमी के कारण, मध्यम एक लाल रंग से एक "भूसे" रंग बदल जाएगा. यदि मध्यम बैंगनी प्रकट होता है, एक बुनियादी पीएच बदलाव हुआ है. यदि मध्यम अत्यंत पीला दिखाई देता है, मध्यम acidified है. बहुत पीला मध्यम अच्छी तरह से या संदूषण में बेहद भीड़ कालोनियों के परिणाम हो सकता है. मध्यम सभी समय पर स्पष्ट दिखाई देनी चाहिए. हालांकि मध्यम में एक सेल मलबे के एक निश्चित स्तर सामान्य है, यह बादल कभी नहीं प्रकट करना चाहिए. यदि सेल मलबे के एक उच्च स्तर पर मनाया जाता है, संस्कृति और स्वस्थ नहीं है दूषित किया जा सकता है.
  4. यदि संस्कृतियों रखरखाव या passaging की आवश्यकता नहीं है, वे जैविक सुरक्षा (खंड 2 देखें) खिलाया जा कैबिनेट में लिया जा सकता है.
  5. यदि संस्कृतियों लगभग 10% कालोनियों फर्क की तुलना में अधिक होते हैं, कोशिकाओं हो "साफ" चाहिए मैन्युअल रूप से विभेदित क्षेत्रों (3 अनुभाग देखें) को हटाने के द्वारा.
  6. यदि संस्कृतियों बड़े या घने कालोनियों होते हैं, या MEF फीडर परत अधिक से अधिक 12 दिनों के पुराना है, कोशिकाओं (अनुभाग 4 देखें) passaged होना चाहिए.

2. दूध पिलाने की HES कक्ष

  1. एक बाँझ जैविक सुरक्षा कैबिनेट में संस्कृति डिश के ढक्कन को हटा दें और खर्च मध्यम aspirate. विंदुक की नोक सीधे कुओं अंदर से दूसरे की थाली के किसी भी भाग को छूने के लिए अनुमति न दें. अगर वहाँ संदूषण के किसी भी चिंता का विषय है, एक नया, बाँझ पिपेट बदल जाते हैं.
  2. एक बाँझ कांच pipet का उपयोग करते समय, हर अच्छी तरह से गरम HES सेल संस्कृति माध्यम से उचित राशि जोड़ें. 6 अच्छी तरह से एक थाली में संस्कृतियों के लिए, अच्छी तरह से प्रति 2.5 एमएल मध्यम जोड़ें.
  3. इनक्यूबेटर की थाली वापसी 37 डिग्री सेल्सियस और 5% सीओ 2 में रहते हैं.

3. HES सेल संस्कृतियों से भेदभाव हटाना

  1. उठा उपकरणों में एक शराब बर्नर के नियंत्रित लौ पर सुझावों मोल्डिंग द्वारा 9 इंच कांच पाश्चर pipettes रूपांतरण. सुनिश्चित करें कि पिपेट की नोक प्रदूषण को रोकने के बंद है और संस्कृति पकवान की प्लास्टिक scratching से बचने के गोल. उपयोग जैविक सुरक्षा कैबिनेट में यूवी प्रकाश स्रोत का उपयोग कर या संलग्नक को चुनने से पहले उठा उपकरण जीवाणुरहित.
  2. विभेदित क्षेत्रों निकालें. भेदभाव अक्सर केवल किनारों के साथ आमतौर पर या केंद्र में पृथक धब्बे के रूप में एक HES सेल कॉलोनी, के एक हिस्से में होता है. यदि केवल एक कॉलोनी के एक खंड फर्क है, केवल विभेदित क्षेत्र को हटा दिया जाना चाहिए. भेदभाव अक्सर बंद थाली उठा सकता है एक "चिपचिपा" पत्रक में, और यह उपयोगी है पहले कॉलोनी के बाकी हिस्सों से उठा उपकरण के अंत के साथ कॉलोनी के माध्यम से एक लाइन ड्राइंग द्वारा विभेदित कोशिकाओं को अलग.
  3. एक बार कॉलोनी के टुकड़े अलग हो रहे हैं, धीरे थाली के साथ उठा उपकरण सरकना अवांछित कोशिकाओं को अलग. ध्यान रखना नहीं कुरेदना दूर इस प्रक्रिया में कालोनियों के बीच बहुत MEF फीडर परत के.
  4. जब विभेदित कोशिकाओं के सभी प्लेट (और मध्यम में तैर) से हटा रहे हैं, जैविक सुरक्षा कैबिनेट संस्कृति वापसी. विभेदित कोशिकाओं से युक्त मध्यम Aspirate और ताजा HES सेल संस्कृति माध्यम के साथ की जगह.

4. Passaging HES कक्ष

एनजाइम ऊष्मायन

  1. एक बाँझ जैविक सुरक्षा कैबिनेट में 6 अच्छी तरह से संस्कृति डिश के ढक्कन को हटा दें और passaged हो कुओं से खर्च मध्यम aspirate. विंदुक की नोक सीधे कुओं अंदर से दूसरे की थाली के किसी भी भाग को छूने के लिए अनुमति न दें.
  2. एक बाँझ कांच pipet का उपयोग, प्रत्येक के लिए passaged होना अच्छी तरह से गरम collagenase चतुर्थ के 1 एमएल जोड़ने.
  3. 5 मिनट के लिए 37 ° सी इनक्यूबेटर थाली लौटें.

Scraping और HES कक्ष Pooling

  1. Collagenase के साथ कोशिकाओं incubating के बाद, खुर्दबीन के नीचे कालोनियों का निरीक्षण करते हैं. एंजाइम कॉलोनी किनारों में एक सूक्ष्म लेकिन नमूदार परिवर्तन का कारण होना चाहिए.
  2. जैविक सुरक्षा कैबिनेट में, धीरे से प्रत्येक में अच्छी तरह से एंजाइम aspirate और 2.0 एमएल HES सेल संस्कृति माध्यम के साथ की जगह.
  3. आप की ओर थोड़ा संस्कृति प्लेट और एक 5 एमएल कांच pipet के साथ पहले अच्छी तरह से में 2.0 एमएल मध्यम ले दी है. प्लेट के नीचे pipet सीधा होल्डिंग, धीरे से अच्छी तरह से भर pipet टिप फिसलना जबकि धीरे धीरे मध्यम जारी है.
  4. Scraping और pipetti दोहराएँएनजी गति 3-4 बार कालोनियों के सभी जब तक अच्छी तरह से हटा दिया गया है. Pipet धीरे में भी छोटे टुकड़े की कालोनियों को तोड़ने से बचने के लिए. जब कोशिकाओं को पहले अच्छी तरह से से हटा दिया गया है, अच्छी तरह से सामग्री को छोड़ दो और कोशिकाओं को अच्छी तरह से अगले बंद scraping शुरू.
  5. जब passaged हो कुओं की सभी scraped किया गया है, प्रत्येक अच्छी तरह से एक बाँझ 15 एमएल शंक्वाकार ट्यूब में कॉलोनी टुकड़े युक्त मध्यम पूल.
  6. प्रत्येक अच्छी तरह HES सेल संस्कृति माध्यम के 1 एमएल जोड़कर scraped कुओं कुल्ला. लीजिए इस कुल्ला और शंक्वाकार ट्यूब करने के लिए स्थानांतरण.
  7. कॉलोनी टुकड़े इच्छित आकार को तोड़ने के लिए ट्यूब में कोशिकाओं धीरे Pipet.
  8. X 200 जी में 5 मिनट के लिए कोशिकाओं अपकेंद्रित्र

HES सेल कक्ष चढ़ाना

  1. जबकि HES कोशिकाओं अपकेंद्रित्र में हैं, एक नया 6 अच्छी तरह से MEF फीडर थाली तैयार करते हैं. लेबल: सेल लाइन, नया बीतने संख्या, और पारित होने की तारीख उपयुक्त HES सेल जानकारी के साथ थाली. कुओं से MEF मध्यम Aspirate और प्रत्येक अच्छी तरह से 1.0 एमएल पीबीएस जोड़ने. धीरे ज़ुल्फ़ कुओं के आसपास बफर और पीबीएस धोने aspirate. हर अच्छी तरह से 1.5 एमएल HES सेल संस्कृति माध्यम जोड़ें और थाली को अलग निर्धारित करें.
  2. जब HES कोशिकाओं centrifuging खत्म हो रहे हैं, ट्यूब वापस लाने जैविक सुरक्षा कैबिनेट. सतह पर तैरनेवाला Aspirate, शिथिल पैक सेल गोली परेशान नहीं सावधान किया जा रहा है.
  3. 1 एमएल HES सेल संस्कृति प्रति अच्छी तरह से माध्यम से मढ़वाया जा के लिए पर्याप्त माध्यम के साथ गोली में कोशिकाओं Resuspend. जब बंटवारे, 6 नए कुएं में 6 एमएल माध्यम से गोली resuspend.
  4. धीरे से और समान रूप से प्रत्येक MEF फीडर प्लेट की अच्छी तरह से तैयार करने के लिए सेल निलंबन के 1 एमएल जोड़ने.
  5. 37 ° सी इनक्यूबेटर में थाली प्लेस और ध्यान की ओर से आगे की थाली वापस करने के लिए, और साइड स्लाइड के समान रूप से अच्छी तरह से भर कोशिकाओं वितरित.
  6. कोशिकाओं को 37 में संलग्न करने के लिए डिग्री सेल्सियस रात भर दें.

5. प्रतिनिधि परिणाम:

Undifferentiated HES कोशिकाओं छोटे कसकर पैक कर रहे हैं, और आम तौर पर कोशिकाओं को बाहर बड़ा और अधिक प्रसार से मिलकर. एक कॉलोनी (चित्रा 1 ए) के भीतर या कालोनियों (चित्रा 3B) के बीच भेदभाव हो सकता है.

विभिन्न morhopologies को खुर्दबीन के नीचे कम बढ़ाई तहत देखा जा सकता है. एक अच्छा सेल आकारिकी, के रूप में चित्र 2A में देखा, छोटे कसकर बांध कोशिकाओं है कि एक monolayer बढ़ने में शामिल हैं. कक्ष साफ, परिभाषित किनारों के साथ कोई भेदभाव करने के लिए थोड़ा होना चाहिए. चित्रा 2B में दिखाया कोशिकाओं passaging के लिए तैयार हैं, और चित्रा 2C में दिखाया कोशिकाओं भीड़ कर रहे हैं.

चित्रा 1
चित्रा 1. HES संस्कृतियों में भेदभाव कॉलोनी के भेदभाव (ए) (बी) कालोनियों के बीच भेदभाव है.

चित्रा 2
चित्रा 2. Morphologies HES संस्कृतियों में देखा. (ए) अच्छा सेल आकारिकी (बी) HES कोशिकाओं है कि भीड़ कोशिकाओं (सी) passaging के लिए तैयार हैं.

Discussion

बाँझपन हर समय बनाए रखा जाना चाहिए जब HES कोशिकाओं के साथ काम कर रहे है. जैविक सुरक्षा कैबिनेट और उपयोग करने से पहले सभी उपकरणों को स्वच्छ और बाँझ. सभी अभिकर्मकों पहले 0.22 सुक्ष्ममापी ताकना आकार फिल्टर का उपयोग कर का उपयोग करने के लिए फ़िल्टर्ड किया जाना चाहिए. HES सेल संस्कृति में antiboiotics का उपयोग आवश्यक नहीं है और बचा जाना चाहिए.

एक अलग वातावरण एक नामित उठा स्टेशन के रूप में स्थापना की जानी चाहिए. स्टेशन के लिए बाँझ बाड़े एक यूवी प्रकाश स्रोत, एक लामिना का प्रवाह डाकू, या एक जैविक सुरक्षा कैबिनेट के साथ एक स्थिर बाड़े (जैसे एक पीसीआर कार्य केंद्र के रूप में) किया जा सकता है. उठा स्टेशन के अंदर एक विदारक माइक्रोस्कोप कालोनियों निरीक्षण के रूप में विभेदित क्षेत्रों को हटा रहे हैं की जरूरत है. एक स्थिर बाड़े या एक जैविक सुरक्षा कैबिनेट के सामने ग्लास पैनल माइक्रोस्कोप के oculars के लिए अनुमति देने के लिए उचित airflow और बाँझपन समझौता किए बिना पैनल के माध्यम से विस्तार करने के लिए संशोधित किया जाना चाहिए.

स्वस्थ HES सेल संस्कृतियों को बनाए रखने के लिए, कोशिकाओं इष्टतम समय passaged हो आम तौर पर हर 4-7 दिन करना चाहिए,. इस समय कालोनियों अपने अधिकतम आकार तक पहुँच चुके हैं और मर्ज शुरुआत हो सकती है. विलय कालोनियों संस्कृति में भेदभाव की दर में वृद्धि कर सकते हैं. भाजित अनुपात 01:03 और 01:05 के बीच आम तौर पर गिरावट, मढ़वाया कालोनियों, विस्तार की दर, और संस्कृति की स्थिति की संख्या पर निर्भर करता है. Overplated कालोनियों (विभाजन का अनुपात बहुत कम है) की संभावना समय से पहले विलय और के लिए passaged होने की जरूरत से पहले वे अपने अधिकतम आकार तक पहुँचने.

एक MEF फीडर परत है कि अधिक से अधिक 2 सप्ताह पुराना है पर संस्कृतियों नए MEFs कि undifferentiated विकास और प्रसार का समर्थन करेंगे पर passaged चाहिए.

के बाद से भेदभाव HES सेल संस्कृतियों में स्वाभाविक रूप से होता है, एक छोटी राशि की उम्मीद है. गोपनीयता या अत्यधिक भेदभाव यदि संस्कृतियों को उचित देखभाल प्राप्त नहीं हो सकता है. कोशिकाओं को हर दिन खिलाया जाना चाहिए, मार्ग के बीच अतिवृद्धि बचा जाना चाहिए. हमेशा ताजा अभिकर्मकों का उपयोग करें. मीडिया MEFs, और अभिकर्मकों के सभी 14 दिनों के भीतर प्रयोग किया जाना चाहिए undifferentiated HES सेल के विकास से बचने के. अभिकर्मकों के नॉकआउट सीरम रिप्लेसमेंट, FBS और MEFs, के रूप में नई बहुत है, से पहले जांच की जानी चाहिए उपयोग करने के लिए. याद रखें कि किसी विभेदित कोशिकाओं को हटा passaging नहीं पहले नए संस्कृतियों के लिए स्थानांतरित कर दिया जाएगा. इसके अलावा, 37 डिग्री सेल्सियस जब भी संभव कोशिकाओं को रखने की कोशिश. समय कोशिकाओं इनक्यूबेटर के बाहर खर्च करते हैं (जैसे खुर्दबीन मंच पर या जैविक सुरक्षा कैबिनेट में) एक गर्म खुर्दबीन मंच बहुत फायदेमंद हो सकता है अगर कोशिकाओं इनक्यूबेटर समय की विस्तारित अवधि के लिए किया जाएगा कर सकते हैं न्यूनतम.

जब खुर्दबीन के नीचे देख HES सेल संस्कृतियों, पहले समग्र गुणवत्ता और देखने के एक कम (2x या 5x) उद्देश्य शक्ति का उपयोग कर कालोनियों के आकार का आकलन. यदि संभावित विभेदित कोशिकाओं को कम सत्ता में मनाया जाता है, विभेदित आकारिकी एक उच्च बढ़ाई उद्देश्य (10X) का उपयोग कर पुष्टि करें.

भेदभाव हटाने के तुरंत बाद, कालोनियों के किनारों दांतेदार या क्षतिग्रस्त प्रकट हो सकता है. ताजा माध्यम से रातोंरात कालोनियों सेते शेष undifferentiated कोशिकाओं को ठीक करने के लिए अनुमति देते हैं. संस्कृति में भेदभाव के प्रभाव के बिना, इन शेष कालोनियों के लिए आम तौर पर पैदा जारी रहेगा.

यदि संभव हो, कम बीतने HES कोशिकाओं का उपयोग प्रयोगों शुरू करते हैं. पहले और बाद में सभी प्रमुख प्रयोगों कोशिकाओं Karyotype.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
D-MEM Invitrogen 11965-092 For MEF medium
Fetal Bovine Serum (FBS), Certified Invitrogen 16000-044 Heat-inactivated
For MEF medium
D-MEM/F-12 Invitrogen 11330-057
Knockout™ Serum Replacement Invitrogen 10828-028 Pre-screen to ensure support of hES cells
bFGF Stemgent 03-0002 Use at [4 ng/mL] final
Non-essential Amino Acids Invitrogen 11140-050
L-glutamine Invitrogen 25030-081 200 mM (100X)
Use at [1X] final
PBS Invitrogen 14190-250 Without Ca2+ or Mg2+
Collagenase IV Invitrogen 17104-019 Make a fresh solution at 1 mg/mL in D-MEM/F-12
Gelatin Sigma-Aldrich G1890 Type A, Porcine
Fetal Bovine Serum (FBS), Defined Hyclone SH300.70.01 For freezing medium
6-well plates Nalge Nunc international 140675 For general culture
4-well plates Nalge Nunc international 176740 For thawing
5 mL glass pipets Fisher Scientific 13-678-27E Individually wrapped
15 mL conical tubes Corning 430052 Polypropylene
Pasteur pipettes Fisher Scientific 13-678-20D 9” glass

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References

  1. Freshney, R. I. Culture of Animal Cells: A Manual of Basic Technique. 5th edition, Wiley-Liss. (2005).

Comments

4 Comments

  1. Isn't it published already in JoVE?

    Reply
    Posted by: Anonymous
    December 23, 2009 - 3:43 PM
  2. From JoVE Editor: we aim to have more than one video-article published for specific methods, especially for popular methods such as culture of ES cells. This is to document and disseminate different ways to perform same experiments to ensure users can choose which to apply in their labs, dependent on the context of their experiments.

    Reply
    Posted by: Moshe P.
    December 23, 2009 - 3:59 PM
  3. Hi,in our lab,Enzyme Incubation need 15-²0 min, could you give me some clue about how could this happened?
    Many thanks!

    Reply
    Posted by: Song W.
    November 13, 2012 - 11:14 PM
  4. Hello! I've just recently started working with a couple of pluripotent stem cell lines (derived by nuclear transfer or induced expression of specific transcription factors). The culturing protocol provided to us specifies the use of trypLE as the dissociation reagent. My first attempt to passage after thawing these lines was problematic - after the 3 minute incubation, the colonies, along with the MEF feeder layer detached from the plate as one big sheet. At no point did I see the characteristic "curling back" of colony edges. Subsequent attempts to dissociate this "sheet" of cells by pipetting were largely unsuccessful. It was a very stringy, sticky mass of cells. Where did I go wrong? Any suggestions/advice would be much appreciated!

    Reply
    Posted by: Xenia S.
    September 8, 2016 - 8:30 AM

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