Isolation und großräumige Ausdehnung der erwachsenen Menschen Endothelial Colony Forming Progenitorzellen

Biology

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Summary

Endothelial koloniebildenden Progenitorzellen (ECFCs) sind ein viel versprechendes Instrument, um vaskuläre Homöostase und Reparatur zu studieren.

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Hofmann, N. A., Reinisch, A., Strunk, D. Isolation and Large Scale Expansion of Adult Human Endothelial Colony Forming Progenitor Cells. J. Vis. Exp. (32), e1524, doi:10.3791/1524 (2009).

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Abstract

Dieser Beitrag stellt eine neuartige Recovery-Strategie für die endotheliale koloniebildenden Progenitorzellen (ECFCs) aus heparinisiertem aber ansonsten unmanipulierten erwachsenen menschlichen peripheren Blut innerhalb einer im Mittel 12 Tage. Nach großräumige Ausdehnung> 1x10 8 ECFCs können für weitere Tests gewonnen werden. Vorteilhaft mit PHPL den Kontakt von menschlichen Zellen mit Rinderserum Antigene ausgeschlossen werden kann. Mittels Durchflusszytometrie und Immunhistochemie die isolierten Zellen können als ECFC und ihre in vitro-Funktionalität zu vaskulären Strukturen bilden können in einer Matrigel-Assay getestet werden charakterisiert werden. Weitere können diese Zellen subkutan in einem Mausmodell injiziert werden, um funktionelle, perfundierten Gefäßen in vivo zu bilden. Nach langfristige Expansion und Kryokonservierung Proliferation, erscheinen Funktion und genomische Stabilität zu erhalten. 3,4

Dieses Tier-Protein-freie Isolierung und Expansion Methode ist leicht anwendbar, um eine große Menge an ECFCs generieren.

Protocol

A.) ECFC ISOLATON

TAG 1:

  1. Bevor Sie mit Start der Vorbereitung des Experiments das Zellkulturmedium Endothelial Growth Medium-2 (EGM-2). Supplement 500ml Endothelial Basal Medium-2 mit Heparin (1ml von 1000 U / ml), 5ml 100x Lösung von Penicillin / Streptomycin (alle Sigma, St. Louis, MO; www.sigmaaldrich.com ), L-Glutamin (2 mM Endkonzentration ) und 50 ml gepoolten menschlichen Thrombozyten-Lysat (PHPL). Dann fügen Sie 0,2 ml Hydrocortison, 2 ml hFGF-B, 0,5 ml VEGF, 0,5 ml EGF, 0,5 ml IGF-1 und 0,5 ml Ascorbinsäure (sofern als SingleQuots, alle Lonza, Walkersville, MD; http://www.lonzabioscience. com / ). Sterile Filtrat das Medium durch einen 0,2 m-Porengröße 500 ml Millipore Vakuum-Filter. Da PHPL bildet kleine Klumpen müssen Sie möglicherweise zwei Filtern für ein Medium. Pre-warm gefiltert EGM-2 bis 37 ° C im Wasserbad
  2. Sammeln Sie die Blutproben, indem 5 ml der erwachsenen menschlichen peripheren Blut aus der Cubitalvene in eine 6ml Konservierungsstoffe Natrium-Heparin-Blut Vacutainer-Röhrchen. Sie sollten die Blutproben innerhalb von maximal zwei Stunden zu bearbeiten.
  3. Beginnen Sie mit der Vorbereitung eine 75 cm 2 (T75; Costar) Kolben mit einem belüfteten Kappe, einer 25 ml Pipette und zwei 5 ml Pipetten in einer laminaren Strömung Bank.
  4. Pre-fill 15 ml vorgewärmten EGM-2 in den Kolben ergänzt mit 25 ml Pipette. Öffnen Sie nun das Blut Fläschchen und Probe alle 5 ml mit 5 ml Pipette in den Kolben. Spülen Sie die leere Blut Fläschchen mit 5 ml zusätzliche EGM-2 mit dem zweiten 5 ml Pipette. Das Gesamtvolumen innerhalb der T75 ist 25 ml. Schließen Sie die entlüftet-Cap der Flasche und in einem Brutschrank bei 37 ° C, 5% CO 2 und 95% Luftfeuchtigkeit für 24 Stunden.

TAG 2:

  1. Nach ca. 24 Stunden (über Nacht) sollten Sie entfernen die mittel-Blut-Gemisch, um loszuwerden, nicht adhärente Zellen. Für diese Ausarbeitung von zwei 25 ml Pipetten und drei 5-ml-Pipetten in der laminaren Strömung, pre-warme 20 ml ergänzt EGM-2 (vorbereitet vom Vortag) und 30 ml PBS auf 37 ° C in einem Wasserbad.
  2. Entfernen Sie den Kolben mit der Probe aus dem Inkubator und entfernen Sie alle den Überstand mit einer 25 ml Pipette. Achten Sie darauf, den Kolben Oberfläche kratzen, um eine Beschädigung mögliche Kolonie. Waschen Sie den inneren Kolben Zelladhärenz Oberfläche dreimal durch vorsichtiges Zugeben von 10 ml vorgewärmtes PBS und Kippen des Kolbens von einer Seite zur anderen. Entfernen Sie die PBS sofort jeder Zeit und zu verwerfen.
  3. 20 ml frisches vorgewärmtes EGM-2 in den Kolben und legen Sie sie zurück in den Inkubator. Dieser Prozess sollte so schnell und schonend wie möglich für die anhaftenden Zellen nicht zu lösen durchgeführt werden. ECFCs leicht lösen, wenn sie in PBS oder bei Raumtemperatur zu lange gehalten werden.
  4. Bildschirm durch den Kolben systemisch jeden zweiten Tag ab Tag zwei mit einem geringer Vergrößerung eines Lichtmikroskops auf der Suche nach ECFC Auswuchs. Wenn eine Kolonie Marke auf der Oberseite zu finden an der Außenseite des Kolbens, der die Position der Kolonie. Beachten Sie, dass die Flaks sollte nicht außerhalb des Inkubators für mehr als 5 Minuten.

TAG 5:

  1. Am fünften Tag nach der Aussaat eine vollständige mittlere Änderung nicht adhärente Zellen zu entfernen. Zu diesem Zweck vorwärmen 20 ml EGM-2 bis 37 ° C im Wasserbad und bereiten zwei 25-ml-Pipetten.
  2. Entfernen Sie den vollständigen Medium mit einer 25 ml Pipette und fügen frische, vorgewärmte ergänzt EGM-2 so schnell wie möglich. Die Zellen sollten nicht ohne Medium für mehr als eine Minute, um zu vermeiden Trocknen gelassen werden. Legen Sie wieder in den Inkubator und wiederholen Screening der Flasche täglich.
  3. Feed the-Zellen durch den Ersatz von 30% des Mediums durch frisches ergänzt EGM-2-mal wöchentlich.

TAG 14-28:

  1. Typische Kolonien mit Kopfsteinpflaster Morphologie sollte etwa 12 Tage angezeigt werden. Mark der oberen Außenseite des Kolbens auf die Position der einzelnen Kolonie zeigen. Lassen Sie den Kolonien bis Tag 28 wachsen, wenn einzelne Zellen zu lösen beginnen. Einmal, sind in erster Linie Kolonien identifiziert sie zwischen den Tagen 14 und 28 geerntet werden kann, abhängig von ihrer Größe.

B.) ECFC HARVEST

  1. Pre-warm 5 ml Trypsin 0,05% / EDTA, 20 ml PBS und 5 ml frisch ergänzt EGM-2.
  2. Vollständig zu entfernen Medium aus der Flasche in ein Falcon-Röhrchen (Vorsicht, nicht an der Oberfläche des Kolbens nicht zu beschädigen mögliche Kolonie touch) und waschen Sie die Zellen vorsichtig mit 10 ml vorgewärmter PBS.
  3. 5 ml Trypsin / EDTA und Inkubation für 5 Minuten in den Inkubator. Die Zellen sollten nicht auf Trypsin für mehr als 7 min ausgesetzt werden, da es giftig wird. Gründlich Antippen der Seiten des Kolbens hilft Zellen zu lösen. Quench Trypsin-Protease-Aktivität durch Zugabe von ca. 10 ml der erhaltenen verwendet Kulturmedium.
  4. Entfernen Zellsuspension in eine 50 ml Falcon Rohr. Waschen Sie die Flasche einmal mit 10 ml PBS, die danach auf den geernteten Zellsuspension zugegeben. Centrifuge die Zellsuspension bei 300 g für 7 min bei 4 ° C zu sammeln die Zellen und entfernen Sie die Trypsin. Überstand verwerfen und Zellpellet sofort in 1 ml PBS. Keep on ice.
  5. Bestimmen der Zellzahl, wie in einem JoVE Protokoll, das von R. Ricardo und K. Phelani beschrieben. 5

C) ECFC EXPANSION

  1. Supplement 500 ml EGM-2 als in A 1.1 beschrieben). Pre-warm bis 37 ° C in einem Wasserbad.
  2. Für etwa 2500 cm 2 Kultur Raum bereiten entweder 11 T220 (225 cm 2) oder 15 T175 (175 cm 2) oder einer vierschichtigen Zellfabrik (CF-4; Nunc, Naperville, IL; http://www.nuncbrand . com ). Zusätzlich benötigen Sie zwei frische Luft-caps und einer speziellen sterilen Trichter in der Laminar-Flow-bench.
  3. Um Samen ECFCs bei einem Ausgangs-Zelldichte von 100 c / cm 2 Berechnung der Zellzahl ist notwendig. Zum einen CF-4 252800 Zellen werden in 500 ml frisches EGM-2 resuspendiert und ergossen sich in die CF-4 mit dem sterilen Trichter. Schließen Sie eine Entlüftung mit der vent-Kappe und kippen Sie das CF-4 zu einer Länge Seite, so dass eine gleichmäßige Verteilung des Mediums zwischen allen 4 Mehle. Dann kippen die Kammer zurück und öffnen Sie den Deckel des vent-cap. Legen Sie CF-4 in Inkubator.
  4. Ändern Sie 20% des Mediums mindestens einmal wöchentlich, bis CF-4 ist konfluent.
  5. Ernten Sie die Zellen wie in B beschrieben) mit 70 ml Trypsin / EDTA und ca. 200 ml PBS.

Repräsentative Ergebnisse

Mit dieser Trennung Methode beobachteten wir eine primäre Koloniebildung am Tag 12. In einer früheren Studie konnten auf einen Mittelwert von 4,0 ± 0,8 ECFC-Kolonien aus jeder ml der peripheren Blut gewonnen zu erholen. 4 ECFCs zeigte eine typische Kopfsteinpflaster Aussehen. Nach großräumige Ausdehnung, mit einer Aussaatdichte von 100 Zellen / cm 2, erhalten wir> 1 x 10 8 Zellen in insgesamt rund 30 Tage aus 3 männlichen und 1 weiblichen Probanden (Alter zwischen 26 und 50 Jahre).

ECFC unter diesen Bedingungen kultiviert wurden gezeigt, dass proliferative, funktional und genomisch stabil. 4 Darüber Zellen gespeichert werden kann (in 10% DMSO) in flüssigem Stickstoff für die weitere Verwendung sein. 3,4

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Discussion

Diese neuartige Isolierung und Expansion Methode ist ein einfaches und effizientes Verfahren, die effizienter und weniger zeitaufwendig, indem es jegliche Zellseparation (keine Dichtegradienten erforderlich) und weniger teuer als herkömmliche Techniken. Durch die Verwendung von PHPL Kontakt zu Rindern Antigene und vermeintlichen späteren xenoimmunization ist ausgeschlossen. Während der Kulturzeit kleine Blutgerinnsel bilden können, die durch die PHPL. Basierend auf unserer Erfahrung diese Blutgerinnsel haben keinen Einfluss auf die Koloniebildung und Zellproliferation oder Funktion.

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Acknowledgments

Die Autoren danken Dr. Katharina Schallmoser für die Bereitstellung PHPL und Margaretha Frühwirth und Daniela Thaler für hervorragende technische Unterstützung.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Endothelial basal Medium-2 Lonza Inc. 500ml
EGM-2 SingleQuots Lonza Inc. EGF, hFGF-B, VEGF, IGF-1, Hydrocortisone, ascorbic acid
preservative-free Heparin Biochrom AG 10U/ml per EGM-2
L-Glutamine Sigma-Aldrich 2mM per EGM-2
Penicillin and Streptomycin Sigma-Aldrich 100U/mL Penicillin and
100μg/mL Streptomycin per
EGM-2
Trypsin/1mM EDTA Invitrogen 7ml for T75 flask
70ml for CF-4
PBS
Four-layered cell factory (CF-4) Corning
Sterile Funnel Corning
T75cm2 culture flask (with vented cap) Corning
6 mL vacutainer tubes (preservative-free sodium heparin) BD Biosciences preloaded with 108 IU/6ml of
preservative-free sodium heparin
50ml Falcon tubes Falcon BD
5ml Stripetts Costar
25ml Stripetts Costar
Squeezer Costar
0,2 pore size sterile filter EMD Millipore 2x 500ml per EGM-2

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Solovey, A., Lin, Y., Browne, P., Choong, S., Wayner, E., Hebbel, R. P. Circulating activated endothelial cells in sickle cell anemia. N Engl J Med. 337, 1584-1590 (1997).
  2. Yoder, M. C., Mead, L. E., Prater, D. Redefining endothelial progenitor cells via clonal analysis and hematopoietic stem/progenitor cell principals. Blood. 109, 1801-1809 (2007).
  3. Schallmoser, K. Rapid large-scale expansion of functional mesenchymal stem cells from unmanipulated bone marrow without animal serum. Tissue Eng Part C Methods. 14, 185-196 (2008).
  4. Reinisch, A. Humanized large-scale expanded endothelial colony-forming cells function in vitro and in vivo. Blood. (2009).
  5. Ricardo, R., Phelan, K. Counting and Determining the Viability of Cultured Cells. J Vis Exp. (2008).

Comments

3 Comments

  1. We tried this protocol and did not get colonies. Has anyone else gotten this protocol to work? Regards,
    Diana

    Reply
    Posted by: Diana P.
    March 26, 2010 - 12:58 PM
  2. Hi Diana,

    We obtained one colony from ² subjects out of 10 healthy donors. For each subject, we plated total ²0ml of blood in four T75 flasks. We were able to expand the cells up to 1.1 X 10E6 into one T75 flask after 48 hours of culture. Cells are currently being expanded in the cell factory. Unfortunately we were not able to reproduce the results plating blood from the same subject that we got the colony. Maybe we still need to improve our technique or maybe there are unknown variables that can affect the amount of ECFC in the circulation at the time of blood collection.

    Micheline

    Reply
    Posted by: Anonymous
    May 7, 2010 - 2:27 PM
  3. Hi Micheline
    Do you use pHPL to replace FBS? Since we followed the author's protocol, very few adherent cells were got after the wash with PBS three times.

    Reply
    Posted by: he f.
    July 19, 2011 - 8:42 AM

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