L'isolement et expansion à grande échelle des cellules adultes humaines Colony Forming progénitrices endothéliales

Biology

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Summary

Cellules endothéliales progénitrices formant colonie (CPEF) sont un outil prometteur pour étudier l'homéostasie vasculaire et de réparation.

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Hofmann, N. A., Reinisch, A., Strunk, D. Isolation and Large Scale Expansion of Adult Human Endothelial Colony Forming Progenitor Cells. J. Vis. Exp. (32), e1524, doi:10.3791/1524 (2009).

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Abstract

Ce document présente une stratégie de rétablissement pour le roman de cellules progénitrices endothéliales formant colonie (CPEF) de l'héparine mais autrement non manipulés pour adultes sang périphérique humain au sein d'une moyenne de 12 jours. Après l'expansion à grande échelle> 1x10 8 CPEF peuvent être obtenus pour d'autres essais. Avantageusement en utilisant pHPL le contact des cellules humaines avec bovin antigènes sériques peut être exclue. Par cytométrie en flux et par immunohistochimie des cellules isolées peuvent être caractérisés comme ECFC et leur fonctionnalité dans vitro pour former des structures vasculaires peuvent être testés dans un essai de Matrigel. De plus, ces cellules peuvent être injectées par voie sous cutanée dans un modèle de souris pour la forme fonctionnelle, des vaisseaux perfusés in vivo. Après l'expansion à long terme et la prolifération cryoconservation, la fonction et la stabilité génomique semblent être préservées 3,4.

Cet isolement des animaux en protéines libres et méthode d'expansion est facilement applicable à générer une grande quantité de CPEF.

Protocol

A.) ECFC ISOLATON

JOUR 1:

  1. Avant de commencer avec l'expérience de préparer la croissance milieu de culture cellulaire endothéliale moyenne-2 (EGM-2). Supplément 500ml endothéliale Basal Medium-2 avec de l'héparine (1ml de 1000 U / ml), solution de 5ml 100x de pénicilline / streptomycine (tous Sigma, St. Louis, MO; www.sigmaaldrich.com ), L-glutamine (2 mM de concentration finale ), et 50 ml commun lysat plaquettaire humain (pHPL). Ensuite, ajoutez 0,2 hydrocortisone ml, 2 ml hFGF-B, 0,5 ml de VEGF, EGF 0,5 ml, 0,5 ml d'IGF-1 et 0,5 ml d'acide ascorbique (à condition que SingleQuots, tous Lonza, Walkersville, MD; http://www.lonzabioscience. com / ). Filtrat stérile de la moyenne grâce à un 0,2 m-taille des pores du filtre 500 ml sous vide Millipore. Depuis pHPL formes petits caillots vous pouvez avoir besoin de deux filtres pour une moyenne. Préchauffer filtrée EGM-2 à 37 ° C dans un bain d'eau
  2. Recueillir des échantillons de sang par le dessin 5 ml de sang périphérique adulte humain de la veine cubitale dans un sans conservateur 6ml de sodium d'héparine tube Vacutainer sang. Vous devez traiter les échantillons de sang dans un délai maximum de deux heures.
  3. Commencez par préparer un 75 cm 2 (T75; Costar) fiole avec un bouchon à évent, une pipette 25 ml et deux pipettes 5 ml dans un banc de flux laminaire.
  4. Pré-remplissage de 15 ml pré-chauffé complété EGM-2 dans le ballon avec la pipette de 25 ml. Maintenant, ouvrez le flacon d'échantillon de sang et tous les 5 ml à la pipette 5 ml dans le flacon. Rincer la fiole de sang vides avec 5 ml d'supplémentaires EGM-2 avec la seconde pipette 5 ml. Le volume total au sein du T75 est de 25 ml. Fermez le bouchon à évent-du flacon et le placer dans une étuve à 37 ° C, 5% de CO 2 et 95% d'humidité pendant 24 heures.

JOUR 2:

  1. Après environ 24 heures (une nuit), vous devriez retirer le mélange du sang moyen de se débarrasser des cellules non adhérentes. Pour préparer ces deux pipettes 25 ml et trois 5 pipettes ml dans le flux laminaire, préchauffer de 20 ml de compléter EGM-2 (préparée le jour précédent) et 30 ml de PBS à 37 ° C dans un bain d'eau.
  2. Retirer le ballon avec l'échantillon de l'incubateur et supprimer tous les surnageant avec une pipette de 25 ml. Prenez soin de ne pas rayer la surface flacon pour éviter d'endommager toute colonie potentiels. Lavez la surface intérieure des cellules flacon adhésion à trois reprises par délicatement en ajoutant 10 ml de PBS préchauffé et en inclinant le flacon d'un côté à l'autre. Retirez le CPE immédiatement à chaque fois et les jeter.
  3. Ajouter 20 ml de frais préchauffé EGM-2 dans le ballon et le replacer dans l'incubateur. Ce processus devrait être effectué aussi rapidement que possible et en douceur pour les cellules attachée à ne pas se détacher. CPEF détachent facilement si elles sont conservées dans du PBS ou à température ambiante pendant trop longtemps.
  4. Ecran à travers le ballon systémique tous les deux jours à partir de deux jours en utilisant un faible grossissement d'un microscope optique à la recherche d'excroissance ECFC. Quand une colonie se trouve la marque sur le dessus sur le côté extérieur de la fiole en indiquant la position de la colonie. Notez que le Flaks ne doit pas être en dehors de l'incubateur pendant plus de 5 minutes.

JOUR 5:

  1. Le cinquième jour après le semis effectuer un changement de milieu complet pour enlever des cellules non adhérentes. Pour ce faire préchauffer 20 ml d'EGM-2 à 37 ° C dans un bain d'eau et de préparer deux pipettes 25 ml.
  2. Retirez le support complet à l'aide d'une pipette de 25 ml et ajouter frais, préchauffé EGM-2 complété dès que possible. Les cellules ne devraient pas être laissés sans moyen de plus d'une minute pour éviter le dessèchement. Placez de nouveau dans l'incubateur et répéter le test du ballon quotidien.
  3. Alimenter les cellules en remplaçant 30% de la moyenne par les frais complété EGM-2 deux fois par semaine.

JOUR 14-28:

  1. Les colonies typiques de morphologie pavées devrait apparaître autour de 12 jours. Marquer le côté supérieur extérieur de la fiole d'indiquer la position de chaque colonie. Autoriser les colonies de croître jusqu'à ce jour 28 cellules individuelles à moins de commencer à se détacher. Une fois, des colonies primaires ont été identifiés, ils peuvent être récoltés entre 14 et 28 jours, en fonction de leur taille.

B.) ECFC MOISSON

  1. Pré-chaud 5 ml de trypsine 0,05% / EDTA, 20 ml de PBS et 5ml frais complété EGM-2.
  2. Complètement éliminer le milieu de la fiole dans un tube Falcon (prendre soin de ne pas toucher la surface du flacon pour éviter d'endommager toute colonie potentiel) et se laver soigneusement les cellules avec 10 ml de PBS préchauffé.
  3. Ajouter 5 ml de trypsine / EDTA et incuber pendant 5 minutes dans l'incubateur. Les cellules ne devraient pas être exposés à la trypsine pendant plus de 7 min, car il devient toxique. Bien tapotant les côtés de la fiole aide les cellules à se détacher. Quench activité de la protéase trypsine en ajoutant environ 10 ml du milieu de culture utilisé préservée.
  4. Retirez la suspension cellulaire dans un Falco 50 mlTube n. Laver le ballon une fois avec 10 ml de PBS qui est ensuite ajouté à la suspension de cellules récoltées. Centrifuger la suspension cellulaire à 300 g pendant 7 min à 4 ° C pour collecter les cellules et enlever la trypsine. Jeter le surnageant et remettre le culot cellulaire immédiatement dans 1 ml de PBS. Restez sur la glace.
  5. Déterminer le nombre de cellules comme décrit dans un protocole JoVE par R. Ricardo et K. Phelani 5.

C) ECFC EXPANSION

  1. Supplément de 500 ml EGM-2 tel que décrit dans A 1.1). Préchauffer à 37 ° C dans un bain d'eau.
  2. Pour environ 2500 cm 2 d'espace de culture de préparer une usine soit 11 T220 (225 cm 2) ou 15 T175 (175 cm 2) ou une cellule de quatre couches (FC-4; Nunc, Chicago, IL; http://www.nuncbrand . com ). En outre, vous aurez besoin de deux nouvelles évent-bouchons et un entonnoir stérile spécial dans le banc d'écoulement laminaire.
  3. Pour CPEF semences à une densité cellulaire initiale de 100 c / cm 2 de calcul du nombre de cellules est nécessaire. Pour un CF-4 252 800 cellules sont resuspendues dans 500 ml fraîche EGM-2 et versé dans les FC-4 en utilisant l'entonnoir stérile. Fermer un évent à l'évent de plafonnement et d'incliner le CF-4 d'un côté de longitude, ce qui permet une répartition égale du milieu entre les 4 farines. Puis inclinez la chambre arrière et ouvrez le couvercle de l'évent-bouchon. Placez CF-4 dans l'incubateur.
  4. Changer 20% de la moyenne au moins une fois par semaine jusqu'à FC-4 est confluente.
  5. Récolte des cellules comme décrit dans B.) en utilisant 70 ml de trypsine / EDTA et environ 200 ml de PBS.

Les résultats représentatifs

En utilisant cette méthode d'isolement, nous avons observé une formation de colonies primaires au jour 12. Dans une étude précédente ont été en mesure de récupérer une moyenne de 4,0 ± 0,8 ECFC-colonies issues de chaque ml de sang périphérique. 4 CPEF a montré un aspect typique en pierre de galets. Après l'expansion à grande échelle, avec une densité de semis de 100 cellules / cm 2, nous avons obtenu> 1 x 10 8 cellules pour un total d'environ 30 jours à partir de 3 hommes et 1 femmes volontaires (âge compris entre 26 et 50 ans).

ECFC cultivés dans ces conditions se sont avérés être proliférative, fonctionnelle et génomiquement stable. 4 En outre les cellules peuvent être stockés (dans 10% de DMSO) dans l'azote liquide pour une utilisation ultérieure. 3,4

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Discussion

Cet isolement roman et la méthode d'extension est un processus simple et efficace qui est plus efficace et moins de temps en évitant toute séparation des cellules (pas de gradient de densité nécessaire) et moins coûteux que les techniques conventionnelles. En utilisant de contact pHPL aux antigènes putatifs bovine et xenoimmunization ultérieure est exclue. Pendant la période de la culture des petits caillots peuvent se former, causée par la pHPL. Basé sur notre expérience de ces caillots n'affectent pas la formation de colonies et la prolifération cellulaire ou la fonction.

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Acknowledgments

Les auteurs remercient le Dr Katharina Schallmoser pour fournir pHPL et Margaretha Frühwirth et Daniela Thaler pour une assistance technique excellente.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Endothelial basal Medium-2 Lonza Inc. 500ml
EGM-2 SingleQuots Lonza Inc. EGF, hFGF-B, VEGF, IGF-1, Hydrocortisone, ascorbic acid
preservative-free Heparin Biochrom AG 10U/ml per EGM-2
L-Glutamine Sigma-Aldrich 2mM per EGM-2
Penicillin and Streptomycin Sigma-Aldrich 100U/mL Penicillin and
100μg/mL Streptomycin per
EGM-2
Trypsin/1mM EDTA Invitrogen 7ml for T75 flask
70ml for CF-4
PBS
Four-layered cell factory (CF-4) Corning
Sterile Funnel Corning
T75cm2 culture flask (with vented cap) Corning
6 mL vacutainer tubes (preservative-free sodium heparin) BD Biosciences preloaded with 108 IU/6ml of
preservative-free sodium heparin
50ml Falcon tubes Falcon BD
5ml Stripetts Costar
25ml Stripetts Costar
Squeezer Costar
0,2 pore size sterile filter EMD Millipore 2x 500ml per EGM-2

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Solovey, A., Lin, Y., Browne, P., Choong, S., Wayner, E., Hebbel, R. P. Circulating activated endothelial cells in sickle cell anemia. N Engl J Med. 337, 1584-1590 (1997).
  2. Yoder, M. C., Mead, L. E., Prater, D. Redefining endothelial progenitor cells via clonal analysis and hematopoietic stem/progenitor cell principals. Blood. 109, 1801-1809 (2007).
  3. Schallmoser, K. Rapid large-scale expansion of functional mesenchymal stem cells from unmanipulated bone marrow without animal serum. Tissue Eng Part C Methods. 14, 185-196 (2008).
  4. Reinisch, A. Humanized large-scale expanded endothelial colony-forming cells function in vitro and in vivo. Blood. (2009).
  5. Ricardo, R., Phelan, K. Counting and Determining the Viability of Cultured Cells. J Vis Exp. (2008).

Comments

3 Comments

  1. We tried this protocol and did not get colonies. Has anyone else gotten this protocol to work? Regards,
    Diana

    Reply
    Posted by: Diana P.
    March 26, 2010 - 12:58 PM
  2. Hi Diana,

    We obtained one colony from ² subjects out of 10 healthy donors. For each subject, we plated total ²0ml of blood in four T75 flasks. We were able to expand the cells up to 1.1 X 10E6 into one T75 flask after 48 hours of culture. Cells are currently being expanded in the cell factory. Unfortunately we were not able to reproduce the results plating blood from the same subject that we got the colony. Maybe we still need to improve our technique or maybe there are unknown variables that can affect the amount of ECFC in the circulation at the time of blood collection.

    Micheline

    Reply
    Posted by: Anonymous
    May 7, 2010 - 2:27 PM
  3. Hi Micheline
    Do you use pHPL to replace FBS? Since we followed the author's protocol, very few adherent cells were got after the wash with PBS three times.

    Reply
    Posted by: he f.
    July 19, 2011 - 8:42 AM

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