6.5 DPC Fare Embriyolar diseksiyonu

Biology

Your institution must subscribe to JoVE's Biology section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

Postimplantation-dönem embriyoların İzolasyon bir gen desenlendirme hücre soy karar verme süreçlerini embriyonik gelişim sırasında çalışma ve analiz etmek için izin verir, fakat erken embriyo uygun diseksiyonu zor olabilir. Bu protokol erken ilkel bir çizgi-dönem embriyoların izole etmek için bir yöntem açıklanır (~ 6.5 gün coitum [DPC).

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Shea, K., Geijsen, N. Dissection of 6.5 dpc Mouse Embryos. J. Vis. Exp. (2), e160, doi:10.3791/160 (2007).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Memeli embriyonik gelişimin erken aşamalarında gen ekspresyonu analizi, gen fonksiyonu, hücre-hücre etkileşimi ve sinyal mekanizmaları bu kılavuzu embriyonik desenlendirme hakkında önemli ipuçları sağlayabilir. Ancak, fare embriyo implantasyonu kısa bir süre sonra desidua diseksiyonu zor bir işlem olabilir ve bu sürecin ayrıntılı adım-adım belgelerine eksiktir.

Burada ilk kez hamile bir fare rahim diseksiyon (vajinal fiş belirlenen gün 0.5 poist coitum tespit) ve daha sonra embriyonun anne desidua diseksiyon post-implantasyon (6.5 DPC) embriyolar nasıl izole edilir göstermektedir. Reichert membran diseksiyonu ectoplacental koni kaldırılması yanı sıra açıklanmıştır.

Protocol

Bir dişi fare üreme organları diseksiyonu

  1. Gebe hayvanlar sıkıştırılmış gaz kullanarak CO 2 boğulma tarafından ötenazi.
  2. Emici ped hayvan yatar Lay ve fare saç diseksiyonu kontamine riskini azaltmak için% 70 etanol içinde bekletin.
  3. Cilt sıkın ve düzenli cerrahi makas ile orta hatta küçük bir yatay kesi yapmak. Sağlam bir şekilde yukarıdan ve kesi altında tutun ve cilt cilt dışında karın ortaya çıkarmak için baş ve kuyruk doğru çekin.
  4. Forseps ile tutun ve periton karın boşluğunda ortaya çıkarmak için kesilmiş.
  5. Iki, rahim boynuzları, yumurtalık ve yumurtalıkların: vücut boşluğuna dorsal bölgedeki üreme organları bulun.

İlkel Streak aşamalı (6.5 DPC) Diseksiyon

  1. Uterin horn rahim yumurtalık altında tutarak çıkarın ve mesometrium boyunca ücretsiz kesmek. Buz PBS disseke rahim yerleştirin.

    Şekil 1

    Şekil 1

  2. Her embriyo rahim boynuz boyunca implantasyon siteler arasında keserek ayırın.

    Şekil 2

    Şekil 2


  3. Saatçilik forseps çevresindeki kas tabakası ve zarflı desidua dokusu arasında kaydırarak kas rahim astar kavrayın. Peel, geri kas tabakası desidua ortaya.

    Şekil 3

    Şekil 3

  4. Midventral veya distal ucu kapalı embriyo gösterecektir apeks (yaklaşık 1 / 5 desidua dokusu) maruz kalan desidua bir kısmını off klibi.

    Şekil 4

    Şekil 4

  5. Forseps ve ipuçlarını kullanarak embriyo kabuklu olabilir. Pierce, forseps ve embriyo çevreleyen açık forseps ile desidua dışında desidua gözyaşı.

    Şekil 5

    Şekil 5

  6. Bir kez embriyo kaldırılır, Reichart membran hala ectoplacental konisi (trofoblast) olarak de bağlı olabilir. Embriyo daha dikkatli diseksiyon ile disseke edilebilir.

    Şekil 6
    Şekil 6

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Fare Postimplantation 4,5 DPC ve doğum arasında oluşur. Bu diseksiyon yöntemi olarak tanımlanan, aslında, önceki veya sonraki 5,5-8,5 DPC sahne embriyolar izole etmek için uygulanabilir.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Type Company Catalog Number Comments
Micro Dissecting Forceps serrated, straight Tool Roboz Surgical Instruments Co. RS-5130 2 pairs
Micro Dissecting Tweezers Pattern #55 INOX Tool Roboz Surgical Instruments Co. RS-5010 2 pairs
Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline (1X) Reagent Invitrogen 14190
Fisherbrand Sterile Polysytrene Petri Dish Tool Fisher Scientific 08-757-12
4% Paraformaldehyde in PBS Reagent
Straight Sharp-Pointed Dissecting Scissors Tool Fisher Scientific 08-940
Pregnant female mice Animal
Dissecting Microscope Microscope

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Nagy, A., et al. Manipulating the mouse embryo: A laboratory manual third edition. Cold Spring Harbor Laboratory. Cold Spring Harbor, New York. (2003).

Comments

6 Comments

  1. How you set the exactly time of embryos stage?
    thanks.

    Reply
    Posted by: Anonymous
    May 6, 2008 - 12:47 PM
  2. One option for obtaining pre-implantation embryos is to set up natural matings.  To set up matings, females (6 weeks to 4 months of age) are placed with males (one or two females in each cage with one male) overnight.  The morning after mating, the females can be checked for the presence of a copulation plug in the vagina.  The presence of the vaginal plug indicates that the mating occured, but it dŒs not always mean that a pregnancy will result.  The convention for timed pregnancy assumes that fertilization takes place around midnight during a 7pm to 5am dark cycle, then at noon on the following day (i.e., the day on which the vaginal plug is found), the embryos are aged "0.5 dpc (days post coitum)".  At noon on the next day, the embryos are 1.5 dpc, and so on. It is important to check for plugs early in the morning because they fall out or are no longer detectable ~1² hours after mating, or sometimes earlier.  It is important to note that embryos within a litter can vary with regard to stage of development.  Therefore, morphological criteria are used when more precise embryo staging is required such as the "Theiler Staging Criteria for Mouse Embryonic Development". 

    Reply
    Posted by: Anonymous
    May 19, 2008 - 7:59 PM
  3. I just want to thank you for posting this video, it was extremely useful.  I am a high school student in Wisconsin and I am doing research in stem cells and I'm trying to perfect my dissection method.  I love learning new methods and new information on this subject.  Thank you again. Sara

    Reply
    Posted by: Anonymous
    May 6, 2008 - 6:35 PM
  4. HI! How do you dissect the embryo out of Reichardt's membrane and ectoplacental cone (passage Fig 6A to B)? Thanks - Delphine

    Reply
    Posted by: Anonymous
    June 19, 2009 - 11:36 AM
  5. Do you know if there are any workshops for isolating e5-e9 mouse embryos? You're video was very helpful.

    Reply
    Posted by: Monika L.
    January 14, 2010 - 6:12 PM
  6. I have the same question. How do you dissect the embryo out of Reichardt's membrane and ectoplacental cone (passage Fig 6A to B)? Are their any tricks? Thanks

    Reply
    Posted by: Zhuoqing F.
    December 27, 2012 - 5:34 AM

Post a Question / Comment / Request

You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

Usage Statistics