Dissectie van 6,5 dpc muizenembryo's

Biology

Your institution must subscribe to JoVE's Biology section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

Isolatie van postimplantatie-stage embryo's maakt het mogelijk om genen patronen te bestuderen en cel-afkomst besluitvorming tijdens de embryonale ontwikkeling te analyseren, maar een goede dissectie van het vroege embryo kan een uitdaging zijn. Dit protocol beschrijft een methode voor het isoleren van vroege primitieve-streep-stadium embryo's (~ 6,5 dagen na de coitum [DPC]).

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Shea, K., Geijsen, N. Dissection of 6.5 dpc Mouse Embryos. J. Vis. Exp. (2), e160, doi:10.3791/160 (2007).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Analyse van genexpressie patronen tijdens de vroege stadia van de embryonale ontwikkeling van zoogdieren kan belangrijke aanwijzingen over genfunctie, cel-cel interactie en signaleren mechanismen die leiden embryonale patronen. Echter, dissectie van de muis embryo van de decidua kort na de implantatie een uitdagende procedure, en gedetailleerde stap-voor-stap documentatie van dit proces ontbreekt.

Hier laten we zien hoe de post-implantatie (6,5 dpc) embryo's worden geïsoleerd door eerst het ontleden van de baarmoeder van een zwangere muis (detectie van de vaginale plug was aangewezen dag 0,5 poist coitum) en vervolgens ontleden van het embryo uit het maternale decidua. De ontleding van membraan Reichert is beschreven, evenals de verwijdering van de ectoplacental kegel.

Protocol

Dissectie van de voortplantingsorganen van een vrouwelijke muis

  1. Drachtige dieren worden gedood door de CO 2 stikken met behulp van samengeperst gas.
  2. Leg het dier rugligging op absorberend kussen en laat deze in 70% ethanol om het risico van besmetting van de dissectie met de muis haar te verminderen.
  3. Knijp de huid en maakt een kleine incisie aan de laterale middellijn met regelmatige chirurgische schaar. Houd de huid stevig vast boven en onder de incisie en uit elkaar te trekken van de huid in de richting van het hoofd en staart naar de buik bloot te leggen.
  4. Pak het buikvlies met een tang en snijd de buikholte bloot te leggen.
  5. Zoek de voortplantingsorganen in het dorsale gebied van de lichaamsholte: twee baarmoeder hoorns, de eileider en de eierstokken.

Primitieve Streak-fase (6.5 dpc) Dissection

  1. Verwijder de baarmoeder hoorn van de baarmoeder vast te pakken onder de eileider en snijd het gratis langs de mesometrium. Plaats ontleed baarmoeder in ijskoud PBS.

    Figuur 1

    Figuur 1

  2. Scheid elk embryo door te snijden tussen de implantatie plaatsen langs de baarmoeder hoorn.

    Figuur 2

    Figuur 2


  3. Pak de gespierde baarmoederslijmvlies door te schuiven horlogemakerij pincet tussen de omringende spierlaag en gehuld decidua weefsel. Trek de spierlaag, het blootstellen van de decidua.

    Figuur 3

    Figuur 3

  4. Knip een deel van de blootgestelde decidua aan de top (ongeveer 1 / 5 van de decidua weefsel) die de midventral of distale tip van de bijgevoegde embryo bloot te leggen.

    Figuur 4

    Figuur 4

  5. Het embryo kan worden beschoten met behulp van de tips van de tang. Doorboren van de decidua met een tang rond de embryo en open tang uit elkaar scheuren decidua.

    Figuur 5

    Figuur 5

  6. Zodra embryo wordt verwijderd, kan Reichart membraan nog steeds zo goed zijn bevestigd als de ectoplacental kegel (trofoblast). Het embryo kan verder worden ontleed door zorgvuldige dissectie.

    Figuur 6
    Figuur 6

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Postimplantatie in de muis optreedt tussen 4,5 dpc en geboorte. Deze dissectie methode kan worden toegepast, in hoofdzaak zoals beschreven, om eerder of later stadium embryo's te isoleren op 5,5-8,5 DPC.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Type Company Catalog Number Comments
Micro Dissecting Forceps serrated, straight Tool Roboz Surgical Instruments Co. RS-5130 2 pairs
Micro Dissecting Tweezers Pattern #55 INOX Tool Roboz Surgical Instruments Co. RS-5010 2 pairs
Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline (1X) Reagent Invitrogen 14190
Fisherbrand Sterile Polysytrene Petri Dish Tool Fisher Scientific 08-757-12
4% Paraformaldehyde in PBS Reagent
Straight Sharp-Pointed Dissecting Scissors Tool Fisher Scientific 08-940
Pregnant female mice Animal
Dissecting Microscope Microscope

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Nagy, A., et al. Manipulating the mouse embryo: A laboratory manual third edition. Cold Spring Harbor Laboratory. Cold Spring Harbor, New York. (2003).

Comments

6 Comments

  1. How you set the exactly time of embryos stage?
    thanks.

    Reply
    Posted by: Anonymous
    May 6, 2008 - 12:47 PM
  2. One option for obtaining pre-implantation embryos is to set up natural matings.  To set up matings, females (6 weeks to 4 months of age) are placed with males (one or two females in each cage with one male) overnight.  The morning after mating, the females can be checked for the presence of a copulation plug in the vagina.  The presence of the vaginal plug indicates that the mating occured, but it dŒs not always mean that a pregnancy will result.  The convention for timed pregnancy assumes that fertilization takes place around midnight during a 7pm to 5am dark cycle, then at noon on the following day (i.e., the day on which the vaginal plug is found), the embryos are aged "0.5 dpc (days post coitum)".  At noon on the next day, the embryos are 1.5 dpc, and so on. It is important to check for plugs early in the morning because they fall out or are no longer detectable ~1² hours after mating, or sometimes earlier.  It is important to note that embryos within a litter can vary with regard to stage of development.  Therefore, morphological criteria are used when more precise embryo staging is required such as the "Theiler Staging Criteria for Mouse Embryonic Development". 

    Reply
    Posted by: Anonymous
    May 19, 2008 - 7:59 PM
  3. I just want to thank you for posting this video, it was extremely useful.  I am a high school student in Wisconsin and I am doing research in stem cells and I'm trying to perfect my dissection method.  I love learning new methods and new information on this subject.  Thank you again. Sara

    Reply
    Posted by: Anonymous
    May 6, 2008 - 6:35 PM
  4. HI! How do you dissect the embryo out of Reichardt's membrane and ectoplacental cone (passage Fig 6A to B)? Thanks - Delphine

    Reply
    Posted by: Anonymous
    June 19, 2009 - 11:36 AM
  5. Do you know if there are any workshops for isolating e5-e9 mouse embryos? You're video was very helpful.

    Reply
    Posted by: Monika L.
    January 14, 2010 - 6:12 PM
  6. I have the same question. How do you dissect the embryo out of Reichardt's membrane and ectoplacental cone (passage Fig 6A to B)? Are their any tricks? Thanks

    Reply
    Posted by: Zhuoqing F.
    December 27, 2012 - 5:34 AM

Post a Question / Comment / Request

You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

Usage Statistics