Dissection של 6.5 עוברים DPC עכבר

Biology

Your institution must subscribe to JoVE's Biology section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

בידוד של postimplantation בשלב עוברי מאפשר ללמוד דפוסים גן ולנתח התא השושלת תהליכי קבלת ההחלטות במהלך ההתפתחות העוברית, אבל לנתיחה תקין של העובר מוקדם יכול להיות מאתגר. פרוטוקול זה מתאר שיטה לבידוד מוקדם פס פרימיטיבי, בשלב עוברי (~ 6.5 ימים הודעה coitum [DPC]).

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Shea, K., Geijsen, N. Dissection of 6.5 dpc Mouse Embryos. J. Vis. Exp. (2), e160, doi:10.3791/160 (2007).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

ניתוח דפוסי ביטוי גנים במהלך השלבים המוקדמים של ההתפתחות העוברית יונקים יכולים לספק רמזים חשובים על תפקוד אינטראקציה גן תאים תאים, מנגנוני איתות כי דפוסים מדריך עובריים. עם זאת, דיסקציה של העובר עכבר decidua זמן קצר אחרי ההשתלה יכול להיות הליך מאתגר, ותיעוד מפורט צעד אחר צעד של תהליך זה הוא חסר.

כאן אנו מדגימים כיצד שלאחר ההשתלה (6.5 DPC) עוברים מבודדים תחילה לנתח את הרחם של עכבר בהריון (זיהוי של coitum את התקע הנרתיק יועד 0.5 poist יום) ולאחר מכן לנתח את העובר מן decidua אימהית. דיסקציה של הממברנה של רייכרט מתואר כמו גם הסרה של חרוט ectoplacental.

Protocol

Dissection של איברי הרבייה של העכבר נקבה

  1. חיות בהריון מומתים בחנק CO 2 באמצעות גז דחוס.
  2. הנח את פרקדן בעלי חיים על משטח סופג ולטבול אותו אתנול 70% כדי להפחית את הסיכון של זיהום דיסקציה עם שיער העכבר.
  3. לצבוט את העור לעשות חתך לרוחב קטן קו האמצע עם מספריים כירורגי רגיל. מתחי את העור היטב מעל ומתחת החתך ומושכים את העור כלפי חוץ הראש והזנב לחשוף את הבטן.
  4. אחוז הצפק עם מלקחיים ולחתוך לחשוף את חלל הבטן.
  5. אתר את איברי הרבייה באזור הגבי של חלל הגוף: שתי קרניים הרחם, oviduct ואת השחלות.

Streak בשלב פרימיטיבי (6.5 DPC) Dissection

  1. הסר את קרן הרחם ידי אחיזה הרחם להלן oviduct ופצע אותו בחינם יחד mesometrium. המקום הרחם גזור בקרח קר PBS.

    איור 1

    איור 1

  2. הפרד העובר על ידי חיתוך בין אתרים ההשתלה יחד קרן הרחם.

    איור 2

    איור 2


  3. תפוס את רירית הרחם שרירים ידי הזזה מלקחיים של שען בין שכבת השריר שמסביב רקמת decidua אפוף. מקלפים את שכבת השריר האחורי, חשיפת decidua.

    איור 3

    איור 3

  4. קליפ את חלק decidua נחשף בפסגת (כ 1 / 5 של הרקמה decidua) אשר יחשוף את קצה midventral או דיסטלי של העובר סגורה.

    איור 4

    איור 4

  5. העובר יכול להיות הפגיזו מחוץ באמצעות קצות מלקחיים. פירס decidua עם מלקחיים המקיפים את העובר ואת מלקחיים לפתוח decidua לקרוע לגזרים.

    איור 5

    איור 5

  6. לאחר העובר מוסר, קרום של רייכרט, עדיין עשויים להיות מצורפים, כמו גם חרוט ectoplacental (trophoblast). העובר יכול להיות גזור נוספת על ידי דיסקציה זהירה.

    איור 6
    איור 6

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Postimplantation בעכבר מתרחשת בין 4.5 DPC והלידה. שיטה זו דיסקציה יכול להיות מיושם, למעשה כמתואר, כדי לבודד מוקדם או מאוחר יותר עוברים לשלב ב 5.5-8.5 DPC.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Type Company Catalog Number Comments
Micro Dissecting Forceps serrated, straight Tool Roboz Surgical Instruments Co. RS-5130 2 pairs
Micro Dissecting Tweezers Pattern #55 INOX Tool Roboz Surgical Instruments Co. RS-5010 2 pairs
Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline (1X) Reagent Invitrogen 14190
Fisherbrand Sterile Polysytrene Petri Dish Tool Fisher Scientific 08-757-12
4% Paraformaldehyde in PBS Reagent
Straight Sharp-Pointed Dissecting Scissors Tool Fisher Scientific 08-940
Pregnant female mice Animal
Dissecting Microscope Microscope

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Nagy, A., et al. Manipulating the mouse embryo: A laboratory manual third edition. Cold Spring Harbor Laboratory. Cold Spring Harbor, New York. (2003).

Comments

6 Comments

  1. How you set the exactly time of embryos stage?
    thanks.

    Reply
    Posted by: Anonymous
    May 6, 2008 - 12:47 PM
  2. One option for obtaining pre-implantation embryos is to set up natural matings.  To set up matings, females (6 weeks to 4 months of age) are placed with males (one or two females in each cage with one male) overnight.  The morning after mating, the females can be checked for the presence of a copulation plug in the vagina.  The presence of the vaginal plug indicates that the mating occured, but it dŒs not always mean that a pregnancy will result.  The convention for timed pregnancy assumes that fertilization takes place around midnight during a 7pm to 5am dark cycle, then at noon on the following day (i.e., the day on which the vaginal plug is found), the embryos are aged "0.5 dpc (days post coitum)".  At noon on the next day, the embryos are 1.5 dpc, and so on. It is important to check for plugs early in the morning because they fall out or are no longer detectable ~1² hours after mating, or sometimes earlier.  It is important to note that embryos within a litter can vary with regard to stage of development.  Therefore, morphological criteria are used when more precise embryo staging is required such as the "Theiler Staging Criteria for Mouse Embryonic Development". 

    Reply
    Posted by: Anonymous
    May 19, 2008 - 7:59 PM
  3. I just want to thank you for posting this video, it was extremely useful.  I am a high school student in Wisconsin and I am doing research in stem cells and I'm trying to perfect my dissection method.  I love learning new methods and new information on this subject.  Thank you again. Sara

    Reply
    Posted by: Anonymous
    May 6, 2008 - 6:35 PM
  4. HI! How do you dissect the embryo out of Reichardt's membrane and ectoplacental cone (passage Fig 6A to B)? Thanks - Delphine

    Reply
    Posted by: Anonymous
    June 19, 2009 - 11:36 AM
  5. Do you know if there are any workshops for isolating e5-e9 mouse embryos? You're video was very helpful.

    Reply
    Posted by: Monika L.
    January 14, 2010 - 6:12 PM
  6. I have the same question. How do you dissect the embryo out of Reichardt's membrane and ectoplacental cone (passage Fig 6A to B)? Are their any tricks? Thanks

    Reply
    Posted by: Zhuoqing F.
    December 27, 2012 - 5:34 AM

Post a Question / Comment / Request

You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

Usage Statistics