Dissection de 6,5 embryons de souris DPC

Biology

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Summary

L'isolement des embryons au stade post-implantation permet d'étudier la structuration génétique et d'analyser les cellules de lignée processus de décision durant le développement embryonnaire, mais la dissection adéquate de l'embryon précoce peut s'avérer difficile. Ce protocole décrit une méthode pour isoler début primitive-série au stade d'embryons (~ 6,5 jours post coïtum [DPC]).

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Shea, K., Geijsen, N. Dissection of 6.5 dpc Mouse Embryos. J. Vis. Exp. (2), e160, doi:10.3791/160 (2007).

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Abstract

L'analyse des profils d'expression génique au cours des étapes précoces du développement embryonnaire chez les mammifères peuvent fournir des indices importants sur la fonction du gène, cellule-cellule d'interaction et les mécanismes de signalisation qui guident la structuration embryonnaire. Cependant, la dissection de l'embryon de souris de la decidua peu après l'implantation peut être une procédure difficile et détaillées étape par étape la documentation de ce processus fait défaut.

Ici, nous montrons comment post-implantation (6,5 DPC) embryons sont isolés d'abord disséquer l'utérus d'une souris enceintes (détection de l'coïtum jour poist bouchon vaginal a été désigné 0,5) et ensuite disséquer l'embryon à partir decidua maternelle. La dissection de la membrane de Reichert est décrite ainsi que la suppression du cône ectoplacentaire.

Protocol

Dissection des organes reproducteurs d'une souris femelle

  1. Les femelles gravides sont euthanasiés par asphyxie à l'aide de CO 2 de gaz comprimé.
  2. Posez le dos des animaux sur le tampon absorbant et la tremper dans de l'éthanol à 70% pour réduire le risque de contamination de la dissection avec les cheveux de la souris.
  3. Pincer la peau et de faire une petite incision latérale à la ligne médiane avec des ciseaux chirurgicaux réguliers. Tenez fermement la peau dessus et en dessous de l'incision et tirez la peau en dehors vers la tête et la queue afin d'exposer l'abdomen.
  4. Saisir le péritoine avec une pince et coupé à exposer la cavité abdominale.
  5. Repérez les organes de reproduction dans la région dorsale de la cavité du corps: deux cornes utérines, l'oviducte et les ovaires.

Primitive Streak stade (6,5 DPC) Dissection

  1. Retirez la corne utérine en saisissant l'utérus ci-dessous l'oviducte et couper le long de la libre mésométrium. Placez l'utérus disséqués dans PBS glacé.

    Figure 1

    Figure 1

  2. Séparez les embryons en coupant entre les sites d'implantation le long des cornes utérines.

    Figure 2

    Figure 2


  3. Saisir la muqueuse utérine en glissant musculaires pince d'horloger entre la couche musculaire et des tissus environnants decidua enveloppés. Peler la couche musculaire, exposant la caduque.

    Figure 3

    Figure 3

  4. Coupez une partie de la caduque exposés à l'apex (environ 1 / 5 du tissu decidua), qui exposera la pointe midventral ou distal de l'embryon clos.

    Figure 4

    Figure 4

  5. L'embryon peut être bombardé à l'aide du bout des pinces. Pierce la caduque avec une pince entourant l'embryon et les forceps ouverte à la déchirure decidua dehors.

    Figure 5

    Figure 5

  6. Une fois que l'embryon est enlevé, la membrane Reichart a peut-être encore attachés, ainsi que le cône ectoplacentaire (le trophoblaste). L'embryon peut être disséqué encore par une dissection minutieuse.

    Figure 6
    Figure 6

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Discussion

Postimplantatoire chez la souris se situe entre 4,5 DPC et de la naissance. Cette méthode de dissection peut être appliquée, essentiellement comme décrit, d'isoler plus tôt ou plus tard au stade de 5.5 à 8.5 embryons DPC.

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Materials

Name Type Company Catalog Number Comments
Micro Dissecting Forceps serrated, straight Tool Roboz Surgical Instruments Co. RS-5130 2 pairs
Micro Dissecting Tweezers Pattern #55 INOX Tool Roboz Surgical Instruments Co. RS-5010 2 pairs
Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline (1X) Reagent Invitrogen 14190
Fisherbrand Sterile Polysytrene Petri Dish Tool Fisher Scientific 08-757-12
4% Paraformaldehyde in PBS Reagent
Straight Sharp-Pointed Dissecting Scissors Tool Fisher Scientific 08-940
Pregnant female mice Animal
Dissecting Microscope Microscope

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References

  1. Nagy, A., et al. Manipulating the mouse embryo: A laboratory manual third edition. Cold Spring Harbor Laboratory. Cold Spring Harbor, New York. (2003).

Comments

6 Comments

  1. How you set the exactly time of embryos stage?
    thanks.

    Reply
    Posted by: Anonymous
    May 6, 2008 - 12:47 PM
  2. One option for obtaining pre-implantation embryos is to set up natural matings.  To set up matings, females (6 weeks to 4 months of age) are placed with males (one or two females in each cage with one male) overnight.  The morning after mating, the females can be checked for the presence of a copulation plug in the vagina.  The presence of the vaginal plug indicates that the mating occured, but it dŒs not always mean that a pregnancy will result.  The convention for timed pregnancy assumes that fertilization takes place around midnight during a 7pm to 5am dark cycle, then at noon on the following day (i.e., the day on which the vaginal plug is found), the embryos are aged "0.5 dpc (days post coitum)".  At noon on the next day, the embryos are 1.5 dpc, and so on. It is important to check for plugs early in the morning because they fall out or are no longer detectable ~1² hours after mating, or sometimes earlier.  It is important to note that embryos within a litter can vary with regard to stage of development.  Therefore, morphological criteria are used when more precise embryo staging is required such as the "Theiler Staging Criteria for Mouse Embryonic Development". 

    Reply
    Posted by: Anonymous
    May 19, 2008 - 7:59 PM
  3. I just want to thank you for posting this video, it was extremely useful.  I am a high school student in Wisconsin and I am doing research in stem cells and I'm trying to perfect my dissection method.  I love learning new methods and new information on this subject.  Thank you again. Sara

    Reply
    Posted by: Anonymous
    May 6, 2008 - 6:35 PM
  4. HI! How do you dissect the embryo out of Reichardt's membrane and ectoplacental cone (passage Fig 6A to B)? Thanks - Delphine

    Reply
    Posted by: Anonymous
    June 19, 2009 - 11:36 AM
  5. Do you know if there are any workshops for isolating e5-e9 mouse embryos? You're video was very helpful.

    Reply
    Posted by: Monika L.
    January 14, 2010 - 6:12 PM
  6. I have the same question. How do you dissect the embryo out of Reichardt's membrane and ectoplacental cone (passage Fig 6A to B)? Are their any tricks? Thanks

    Reply
    Posted by: Zhuoqing F.
    December 27, 2012 - 5:34 AM

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