Dissekering av 6,5 DPC musembryon

Biology

Your institution must subscribe to JoVE's Biology section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

Isolering av postimplantation steg embryon som gör att man kan studera gen mönstring och analysera cell-härstamning beslutsprocesser under fosterutvecklingen, men ordentlig dissekering av det tidiga embryot kan vara en utmaning. Detta protokoll beskriver en metod för att isolera tidiga primitiva-strimma steg embryon (~ 6,5 dagar efter coitum [DPC]).

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Shea, K., Geijsen, N. Dissection of 6.5 dpc Mouse Embryos. J. Vis. Exp. (2), e160, doi:10.3791/160 (2007).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Analys av mönster genuttryck under tidiga stadier av däggdjurs embryonala utveckling kan ge viktiga ledtrådar om geners funktion, cell-cell interaktion och signalering mekanismer som styr embryonala mönster. Däremot kan dissekering av musen embryot från decidua kort efter implantation vara en utmanande förfarande och detaljerade steg-för-steg dokumentation av denna process saknas.

Här kan vi visa hur post-implantation (6,5 DPC) embryon som är isolerade genom att först dissekera livmodern av en gravid mus (detektion av vaginala kontakten utsågs dag 0,5 poist coitum) och därefter dissekera ett embryo från moderns decidua. Dissektion av Reichert membran beskrivs samt borttagning av ectoplacental konen.

Protocol

Dissekering av reproduktiva organ från en kvinnlig mus

  1. Gravida djur avlivas av CO 2 kvävning med komprimerad gas.
  2. Lägg djuret liggande på absorptionsdyna och dränk den i 70% etanol för att minska risken för kontaminering av dissektion med musen hår.
  3. Nyp ihop huden och gör en liten laterala snitt vid mittlinjen med vanlig kirurgisk sax. Håll huden ordentligt över och under snittet och dra i huden isär mot huvud och svans för att avslöja buken.
  4. Ta tag i bukhinnan med pincett och skär avslöja bukhålan.
  5. Leta reda på fortplantningsorganen i dorsala region av kroppen hålrum: två livmoder horn eller äggledare och äggstockar.

Primitivstrimman steg (6,5 DPC) Dissection

  1. Ta bort livmodern horn genom att ta tag i livmodern under äggledare och skär den fria längs mesometrium. Placera dissekerade livmodern i iskallt PBS.

    Figur 1

    Figur 1

  2. Separera varje embryo genom att klippa mellan implantationsställen längs uterin horn.

    Figur 2

    Figur 2


  3. Ta tag i muskulösa livmoderslemhinnan genom att skjuta urmakare pincetten mellan den omgivande muskler lagret och insvept decidua vävnad. Dra av muskel lagret, exponera decidua.

    Figur 3

    Figur 3

  4. Klipp bort en del av den exponerade decidua i toppen (ca 1 / 5 av de decidua vävnad) som kommer att utsätta den midventral eller distala toppen av den medföljande embryot.

    Figur 4

    Figur 4

  5. Embryot kan skalade ut med hjälp av tips av peang. Stick hål på decidua med pincetten kring embryot och öppna pincett att riva decidua isär.

    Figur 5

    Figur 5

  6. När embryot är borttagen, kan Reichart membran fortfarande bifogas liksom ectoplacental konen (trofoblaster). Embryot kan dissekeras ytterligare genom noggrann dissektion.

    Figur 6
    Figur 6

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Postimplantation hos mus sker mellan 4,5 DPC och födelse. Denna dissektion metod kan tillämpas i huvudsak enligt beskrivningen, att isolera tidigare eller senare skede embryon på 5,5-8,5 DPC.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Type Company Catalog Number Comments
Micro Dissecting Forceps serrated, straight Tool Roboz Surgical Instruments Co. RS-5130 2 pairs
Micro Dissecting Tweezers Pattern #55 INOX Tool Roboz Surgical Instruments Co. RS-5010 2 pairs
Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline (1X) Reagent Invitrogen 14190
Fisherbrand Sterile Polysytrene Petri Dish Tool Fisher Scientific 08-757-12
4% Paraformaldehyde in PBS Reagent
Straight Sharp-Pointed Dissecting Scissors Tool Fisher Scientific 08-940
Pregnant female mice Animal
Dissecting Microscope Microscope

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Nagy, A., et al. Manipulating the mouse embryo: A laboratory manual third edition. Cold Spring Harbor Laboratory. Cold Spring Harbor, New York. (2003).

Comments

6 Comments

  1. How you set the exactly time of embryos stage?
    thanks.

    Reply
    Posted by: Anonymous
    May 6, 2008 - 12:47 PM
  2. One option for obtaining pre-implantation embryos is to set up natural matings.  To set up matings, females (6 weeks to 4 months of age) are placed with males (one or two females in each cage with one male) overnight.  The morning after mating, the females can be checked for the presence of a copulation plug in the vagina.  The presence of the vaginal plug indicates that the mating occured, but it dŒs not always mean that a pregnancy will result.  The convention for timed pregnancy assumes that fertilization takes place around midnight during a 7pm to 5am dark cycle, then at noon on the following day (i.e., the day on which the vaginal plug is found), the embryos are aged "0.5 dpc (days post coitum)".  At noon on the next day, the embryos are 1.5 dpc, and so on. It is important to check for plugs early in the morning because they fall out or are no longer detectable ~1² hours after mating, or sometimes earlier.  It is important to note that embryos within a litter can vary with regard to stage of development.  Therefore, morphological criteria are used when more precise embryo staging is required such as the "Theiler Staging Criteria for Mouse Embryonic Development". 

    Reply
    Posted by: Anonymous
    May 19, 2008 - 7:59 PM
  3. I just want to thank you for posting this video, it was extremely useful.  I am a high school student in Wisconsin and I am doing research in stem cells and I'm trying to perfect my dissection method.  I love learning new methods and new information on this subject.  Thank you again. Sara

    Reply
    Posted by: Anonymous
    May 6, 2008 - 6:35 PM
  4. HI! How do you dissect the embryo out of Reichardt's membrane and ectoplacental cone (passage Fig 6A to B)? Thanks - Delphine

    Reply
    Posted by: Anonymous
    June 19, 2009 - 11:36 AM
  5. Do you know if there are any workshops for isolating e5-e9 mouse embryos? You're video was very helpful.

    Reply
    Posted by: Monika L.
    January 14, 2010 - 6:12 PM
  6. I have the same question. How do you dissect the embryo out of Reichardt's membrane and ectoplacental cone (passage Fig 6A to B)? Are their any tricks? Thanks

    Reply
    Posted by: Zhuoqing F.
    December 27, 2012 - 5:34 AM

Post a Question / Comment / Request

You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

Usage Statistics