Yetişkin Zebra balığı Organları diseksiyonu

Published 3/04/2010
13 Comments
  CITE THIS  SHARE 
Biology
 

Summary

Bu protokol, yetişkin zebrafish organların tanımlanması ve diseksiyon için bir prosedür açıklanmıştır.

Cite this Article

Copy Citation

Gupta, T., Mullins, M. C. Dissection of Organs from the Adult Zebrafish. J. Vis. Exp. (37), e1717, doi:10.3791/1717 (2010).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Son 20 yıl içinde, Zebra balığı omurgalı geliştirme ve hastalık anlamak için güçlü bir model organizma haline gelmiştir. Embriyo ve larva deneysel analizi kapsamlı ve morfolojisi iyi belgelenmiş oldu rağmen, yetişkin ile çalışma teknikleri ile birlikte, yetişkin zebrafish anatomi ve yetişkin yapıları ve organları geliştirme çalışmaları açıklamaları, eksiktir. Larva organları genel yapısı, morfolojisi ve larva yetişkin geçiş sırasında anatomik konumu önemli değişikliklere uğrarlar. Içsel organları büyük bir büyüme ve yeniden yapılanma tabi iken Dışarıdan şeffaf, larva, onun karakteristik yetişkin çizgili pigment desen ve eşleştirilmiş pelvik yüzgeçler gelişir. Buna ek olarak, bipotential gonad primordium testis ya da over olarak gelişir. Bu protokol birçok yetişkin organlarının tanımlayan ve beyin, gonadlar, gastrointestinal sistem, kalp ve böbrek yetişkin zebrafish diseksiyon için yöntemler göstermektedir. Disseke organların in situ hibridizasyon, immunohistokimya, histoloji, RNA ekstraksiyonu, protein analizi, ve diğer moleküler teknikler kullanılabilir. Bu protokol, larva organların yeniden şekillenme, yetişkin yetişkin organ sistemleri ve diğer tetkikler için özel organların morfolojilerinden zebrafish çalışmaların genişletilmesi yardımcı olacaktır.

Protocol

  1. Bir erkek Zebra balığı dişi balık tarafından, ilk olarak disseke olacaktır. Diseksiyonu başlamadan önce,% 0.2 Tricaine bir balık uyutmak ve sonra buzlu suda 15 dakika boyunca kuluçka euthanize.
  2. Balık, kuru bir kağıt havlu üzerine hafifçe okşamaya ve bir diseksiyon mat üzerine yerleştirerek başlayın. Dıştan, zebrafish tek dorsal, kaudal ve anal yüzgeçleri ve eşleştirilmiş pektoral ve pelvik yüzgeçler (Şekil 1) var.

    Şekil 1

    Şekil 1 etiketli yüzgeçleri Yetişkin erkek balık.
  3. Diseksiyon mat balık etli kısmından kuyruk ve ventral kısmı göz soket pin.
  4. Anal yüzgeci sadece ön balığın karnından cilt Snip. Anal yüzgeci operculum'un göbek boyunca deri ve alttaki kas (solungaç üzerinden sabit kapsayan) (Şekil 2, adım 1) kesin.

    Şekil 2

    Şekil 2 cilt ve vücut duvarı kas kaldırarak iç organlarda ortaya çıkarmak için adımlar.
  5. Daha sonra, göğüs kuşak (yüzgeci tabanı kalın, kemikli bölge) (Şekil 2, adım 2) dahil olmak üzere, operculum'un ve göğüs yüzgeci çıkarın. Anal fin (Şekil 2, 3. adım) daha sonra balık yan boyunca kesin ve şimdi maruz solungaç posteriora üzerindeki deri ve alttaki kas başında.
  6. Balık yan cilt ve cilt altındaki kas dikkatlice çıkarın. Iç organların çoğu artık görünür (Şekil 3).

    Şekil 3

    Şekil 3 Yetişkin erkek balık, vücut duvarı ve kas ile iç organların görüntülenmesi izin kaldırıldı .
  7. Testisler dorsal vücut duvara bağlı uzun, beyaz, eşleştirilmiş organları. Testis çıkarın ve PBS bir tabak koyun. Spermatagonia gelen spermatid gelişmekte olan germ hücreleri çeşitli aşamalarında (Leal ve ark, 2009) ile kist içeren seminifer tübüller (Şekil 4), görselleştirmek için yansıyan ışık ile testis inceleyin.

    Şekil 4

    Şekil 4 testis diseksiyonu. Beyaz yuvarlak yapılar seminifer tübüller.
  8. Sonra, gastrointestinal sistem, balığın vücut boşluğuna çıkarın. Karaciğer büyük boyutu, loblu morfolojisi, tannish renk ve geniş vaskülarizasyon tarafından tespit edilebilir. Iç organları parlak kırmızı görünen safra kesesi, yeşil saydam bir sıvı dolu kese ve dalak, içinde bulundu.
  9. Organların geri kalanından ayrı ve bağırsak dışarı uzatmak. Bağırsak, orta, ön ve arka bölgelerde epitel kıvrımlarının yüksekliği (Wallace ve ark, 2005) tarafından tanımlanmıştır.
  10. PBS içinde bağırsağın bir parçası yerleştirin ve iletilen ışık kullanarak epitel kıvrımları gözlemlemek.
  11. Ardından, yüzme kesesi inceleyin. Pnömatik kanalı ve Weberci cihazları (Finney ve ark, 2006) yoluyla iç kulağa bağlı bir ön kamara ile yemek borusuna bağlı bir arka odası, yüzme kesesi oluşur.
  12. Kesesi çıkarın ve atın. Balık Çıkar'ı ve yeniden-pin ventral taraf dorsal vücut duvarı boyunca yer alan böbrek, incelemek. Böbrek dorsal aorta ve pigmentli hücreleri ile ilişkili bir saydam pembe bir yapıdır. Böbrek, baş, gövde, ve kuyruk bölgeleri (Şekil 5) bölünmüştür. Böbrek bir parça inceleyin ve PBS yerleştirin. Renal tübüller ortaya çıkarmak için, böbrek dokusu ayrı Tease.

    Şekil 5

    Şekil 5, baş, gövde, ve kuyruk dorsal vücut duvarı boyunca böbrek yeri .
  13. Bir kadın bir balık teşrih. Daha önce açıklandığı gibi, buzlu suda balık euthanize ve diseksiyon mat bağlantılarını önce kuru pat. Daha önce de gösterildiği gibi balık yan deri çıkarın. Yumurtalık vaskülarize mesovarium vücut boşluğunda asılı bir loblu bir yapıdır.
  14. Yumurtalık biri lob çıkarın, PBS yerleştirin ve iletilen ışık incelemek. Oosit ince iğneler kullanılarak dışında alay ve sonra (Şekil 6, Selman ve ark, 1993) sahnelenen olabilir. Evre I oosit yaklaşık 10 - 150 mikron boyutu ve saydam. Boyutu 350 mikron ve kortikal granül görünümü tarafından tanımlanan - Evre II oosit yaklaşık 150. Evre III oosit 350 - 750 mikron boyutunda ve sarısı birikimi nedeniyle opak. Olgun Evre IV ve V oosit saydam ve genellikle son zamanlarda evlendirilen kadın yumurtalıklarda bulundu.

    Şekil 6

    Şekil 6 Canlı sahne I, II ve III oosit altında gözleniriletilen ışık mikroskobu diseksiyon.
  15. Sonra, balık kalp teşrih. Kalp ve solungaç ventral posterior yer almaktadır. Kalp ve çevresindeki doku kesme ve PBS içinde yerleştirerek başlayın. Dikkatli bir şekilde hassas atrium zarar vermemek için dikkatli olmak, kalbi saran doku uzak teşrih.
  16. Disseke kalp kalp atışı gözlemlemek için Ringer solüsyonu içine yerleştirin.
    Atriyum, ventrikül ve bulbus arteriosus (Şekil 7, Hu ve ark, 2001) belirleyin.

    Şekil 7

    Şekil 7 erişkin kalp Dissected.
  17. Balık beyin kaldırarak diseksiyonu tamamlayın. Balık unpinning ve bir jilet ile baş kaldırarak başlayın. Forseps ile kafatası ventral taraftan, mümkün olduğu kadar yumuşak doku çıkarın. Gözleri küçük yaylı makas kullanılarak çıkarın. Kafatası açık Break ve beynin ventral tarafında kemik kaldırmak. Şimdi PBS bir tabak içinde kafa ve beyin dorsal tarafında deri ve kafatası kemikleri çıkarın.
  18. Koku ampuller belirlenmesi, telencephalon, habenula, optik tectum, serebellum ve medulla (Schilling, Şekil 8, 2002 Wullimann ve ark, 1996).

    Şekil 8

    Şekil 8 Dissected yetişkin zebrafish beyin. Üst dorsal anterior görünümü.

Disclosures

University of Pennsylvania Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Kurulu tarafından belirlenen kurallara ve yönetmeliklere uygun olarak hayvanlar üzerinde deneyler yapıldı.

Acknowledgements

Bu çalışma, MCM ve TG Amerikan Kanser Derneği Doktora Sonrası Araştırma Bursu # PF-05-041-01-DDC NIH hibe R01 HD050901 tarafından desteklenmiştir.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Reagents:
0.2% Tricaine (ethyl 3-aminobenzoate)
200 mg tricaine powder
97.9 ml DD water
~1 ml 1 M Tris (pH 9)
Adjust pH to 7.0
Phosphate buffered saline (PBS)
4.0 g NaCl
0.1 g KCl
100 ml 0.1 M PO4 Buffer, pH 7.3
150 ml dH2O
Ringer’s solution
6.7g NaCl
0.2g KCl
0.2g CaCl2
1.2g Hepes
1 L H2O
Adjust pH to 7.2
Dissecting dish with mat Electron Microscopy Sciences 70540
Vannas spring scissors Fine Science Tools 91500-09

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Finney, J. L., Robertson, G. N., McGee, C. A., Smith, F. M., Croll, R. P. Structure and Autonomic Innervation of the Swim Bladder in the Zebrafish (Danio rerio). J Comp Neurol. 495, 587-606 (2006).
  2. Hu, N., Yost, H. J., Clark, E. B. Cardiac morphology and blood pressure in the adult zebrafish. Anat Rec. 264, 1-12 (2001).
  3. Leal, M. C., Cardoso, E. R., Nóbrega, R. H., Batlouni, S. R., Bogerd, J., França, L. R., Schulz, R. W. Histological and stereological evaluation of zebrafish (Danio rerio) spermatogenesis with an emphasis on spermatogonial generations. Biol Reprod. 81, 177-187 (2009).
  4. Schilling, T. F. The morphology of larval and adult zebrafish. Zebrafish: A Practical Approach (The Practical Approach Series). Nusslein-Volhard, C., Dahm, R. Oxford University Press. (2002).
  5. Selman, K., Wallace, R., Sarka, A., Qi, X. Stages of oocyte development in the Zebrafish, Brachydanio rerio. J. Morphol. 218, 203-224 (1993).
  6. Wallace, K. N., Akhter, S., Smith, E. M., Lorent, K., Pack, M. Intestinal growth and differentiation in zebrafish. Mech Dev. 122, 157-173 (2005).
  7. Wullimann, M. F., Rupp, B., Reichert, H. Neuroanatomy of the zebrafish brain : a topological atlas. Birkhäuser Verlag. (1996).

Comments

13 Comments

  1. Dear
    Tripti & Mary
    Thanks for such a nice publication. I will be highly obliged if you could send me a full text of this article. I am really impressed by your presentation here.
    I shall be thankful to you
    Cheers
    Avdesh

    Reply
    Posted by: Anonymous
    March 21, 2010 - 4:42 AM
  2. Dear Avdesh,
    Thanks! The article is now OPEN Access, so you should be able to access everything online.
    Mary

    Reply
    Posted by: Anonymous
    June 29, 2010 - 9:57 PM
  3. Congratulation for this well done video. It will be very useful for my students.
    Carla Lucini

    Reply
    Posted by: carla l.
    June 9, 2010 - 3:15 AM
  4. Thank you very much for this very useful presentation.

    Reply
    Posted by: Anonymous
    July 16, 2010 - 11:57 AM
  5. Dear
    Tripti & Mary
    First of all congratulations for this well done video..
    My questions are:
    The microscopic aspects of the kidney are similar to human? glomeruli, tubules, interstitium? which part of the kidney should I analyze?
    Thanks
    Antonio

    Reply
    Posted by: michele b.
    August 24, 2010 - 9:56 AM
  6. Dear colleagues Tripti and Mary,
    Thank you very much for your higly professional anatomical and histological investigation as video. It will be very usefull for one of my doctorants.
    But I have got a question: were they wild zebrafish or transgenic ones?
    Sincerely yours,
    Prof. Mikodina Ekaterina Victorovna, Russian Federal Research Institute of Fisheries and Oceanography, Moscow

    Reply
    Posted by: Anonymous
    August 2, 2011 - 7:32 AM
  7. They were wild-type zebrafish.
    Mary

    Reply
    Posted by: Anonymous
    August 2, 2011 - 12:22 PM
  8. Dear Tripti & Mary:
    Thanks for this great work, this is really usefull to me, because i begin my Phd Studies and i will work with zebrafish.
    Regards from Chile!.
    Mario Caruffo.

    Reply
    Posted by: Anonymous
    August 28, 2011 - 1:51 AM
  9. Tripti and Mary,

    Thank you for posting this very helpful video. I am considering producing Zebrafish antibodies and this organ dissection study demonstrates that the process of tissue extraction can be done quickly and easily with trained hands.
    Many thanks for your detailed and thorough walk through.

    Reply
    Posted by: Anonymous
    September 26, 2011 - 5:28 PM
  10. Dear Tripti and Mary,
    Let me congratulate first...for this great job,
    Know I am confident that we can start our research with Zebra fish.
    Thanks a lot for sharing your knowledge and experience.
    regards
    Rakhi

    Reply
    Posted by: Anonymous
    February 1, 2012 - 6:43 AM
  11. MOHAMED ASIK R


    Thank you for posting this video, I need this video for dissection of zebra fish for toxicity studies. So i pleased to you for sent this video for my research work.
    Thank you.

    Reply
    Posted by: MOHAMED A.
    January 24, 2014 - 7:23 AM
  12. Hello,

    I am trying to identify the gonads in zebrafish and I am wondering at what magnification are figures 4 (testis) and 5 (stages of oocyte) shown.

    Thank you.

    Reply
    Posted by: Jevi A.
    May 12, 2014 - 9:59 PM
  13. thank you for posting this video
    , it was very helpful for my research work

    Reply
    Posted by: Anju t.
    June 15, 2015 - 1:32 PM

Post a Question / Comment / Request

You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

Video Stats