Neutrophiles pièges extracellulaires: Comment générer et de les visualiser

Immunology and Infection
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Summary

Neutrophiles pièges extracellulaires (NET) sont un important mécanisme immunitaire inné pour combattre les bactéries pathogènes, champignons et parasites. Nous décrivons ici les méthodes d'isoler granulocytes neutrophiles dans le sang humain et de les activer pour former NET. Nous présentons les techniques de préparation de visualiser NET en microscopie optique et électronique.

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Brinkmann, V., Laube, B., Abu Abed, U., Goosmann, C., Zychlinsky, A. Neutrophil Extracellular Traps: How to Generate and Visualize Them. J. Vis. Exp. (36), e1724, doi:10.3791/1724 (2010).

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Abstract

Granulocytes neutrophiles sont le groupe le plus abondant de leucocytes dans le sang périphérique. Comme phagocytes professionnels, ils engloutissent les bactéries et les tuer quand leur niveau intracellulaire fusible antimicrobien granulés avec le phagosome. Nous avons constaté que les neutrophiles ont un moyen supplémentaire de tuer les microorganismes: lors de l'activation, ils libèrent des protéines de granules et de la chromatine qui forment ensemble les fibres extracellulaires qui lient les agents pathogènes. Ces nouvelles structures, ou des neutrophiles pièges extracellulaires (EVF), dégradent les facteurs de virulence et de tuer les bactéries 1, 2 champignons et des parasites 3. L'épine dorsale de structure des EVF est de l'ADN, et ils sont rapidement dégradés en présence des DNases. Ainsi, les bactéries exprimant DNases sont plus virulents 4. En utilisant la microscopie corrélative alliant MET, MEB, immunofluorescence et de vivre des techniques d'imagerie cellulaire, nous avons pu montrer que lors de la stimulation, les noyaux des neutrophiles perdent leur forme et de l'UE et l'hétérochromatine homogénéiser. Plus tard, l'enveloppe nucléaire et les membranes des granules se désintègrent en permettant le mélange des composants NET. Enfin, les filets sont libérés que les pauses membrane cellulaire. Ce programme de mort cellulaire (NETosis) est distinct de l'apoptose et nécrose et dépend de la génération d'espèces réactives de l'oxygène par la NADPH oxydase 5.

Neutrophiles pièges extracellulaires sont abondants dans les sites d'inflammation aiguë. NET semble être une forme de la réponse immunitaire innée que les microorganismes se lier, de les empêcher de se répandre, et assurer une forte concentration locale d'agents antimicrobiens à dégrader les facteurs de virulence et de tuer les agents pathogènes permettant ainsi neutrophiles de remplir leur fonction antimicrobienne même au-delà de leur durée de vie. Il ya plus de preuves, cependant, que les filets sont également impliqués dans les maladies qui vont de syndromes auto-immuns à l'infertilité 6.

Nous décrivons des méthodes pour isoler granulocytes neutrophiles du sang périphérique humain 7 et les inciter à former des développements. Aussi nous inclure des protocoles de visualiser les filets dans la microscopie optique et électronique.

Protocol

1. Isolement PMN du sang humain

Utilisez environ 24 ml de sang humain avec de l'EDTA ou héparine (10 U / ml) comme anticoagulant.

  1. Ajouter 6 ml 1119 Histopaque à un tube Falcon de 15 ml et soigneusement ml de sang couche de 5 à 7 entières sur le dessus.
  2. Centrifuger pendant 20 minutes à 800 xg sans freinage.
  3. Aspirer et jeter jaunâtres et clairs couche supérieure et le transfert phase inférieure rougeâtre contenant des granulocytes dans des tubes Falcon frais.
  4. Laver les cellules en remplissant des tubes Falcon avec du PBS et centrifuger pendant 10 minutes à 300 x g.
  5. En attendant de préparer une solution de Percoll à 100% en mélangeant 18 ml de Percoll avec 2 ml de PBS 10x. Avec 1x PBS préparer 4 solutions ml de 85%, 80%, 75%, 70% et 65% de Percoll.
  6. Préparer deux tubes Falcon avec un gradient de Percoll par superposition de 2 ml de chaque point de pourcentage au-dessus de l'autre dans l'ordre décroissant.
  7. Après centrifugation éliminer le surnageant, mélanger et remettre granulés cellules sédimentées dans 4 ml de PBS.
  8. Soigneusement couche 2 ml de la remise en suspension sur chacun des gradients.
  9. Centrifuger pendant 20 minutes à 800 xg sans freinage.
  10. Après centrifugation retirer la couche supérieure et la plupart des 65% de la couche avec des PBMC et de recueillir des blancs interphases restant jusqu'à 85% de la couche dans des tubes Falcon de nouvelles.
  11. Laver les cellules en remplissant des tubes Falcon avec du PBS et centrifuger pendant 10 minutes à 300 x g.
  12. Retirer le surnageant et remettre les cellules sédimentées (généralement> 95% sont PMN) dans 2ml de PBS.
  13. Compter les cellules en utilisant un hématimètre.

2. Activation PMN

  1. Préparer une plaque de 24 puits de culture cellulaire en mettant une solution stérile de 13 mm de glissement rondes couvercle en verre (# 1,5) dans chaque puits
  2. Graine 2 x 10 5 cellules dans 500μl RPMI (contenant 2% de sérum albumine humaine) par puits et incuber pendant 1h de CO 2 étuve à 37 ° C.
  3. Pendant ce temps préparer une solution de 600 nM PMA dans RPMI et ajouter aux cellules 100 ul par puits. Incuber de 15 min à 4 h de CO 2 étuve à 37 ° C.
  4. Fixer les cellules de 4% (concentration finale) paraformaldéhyde dissous dans du PBS.

PMA sert de contrôle positif et est jusqu'à présent l'agent le plus puissant pour induire la formation de NET. Alternativement, d'autres stimuli ou de co-culture avec des agents pathogènes peut être utilisé pour l'induction NET.

Le statut respectif de la formation des NET peut être vérifiée tout au cours du temps se déroule, si d'autres échantillons sont préparés en parallèle. Si un colorant d'ADN non-pénétrants, comme Sytox vert (Invitrogen) est ajouté aux cellules non-fixes, seul l'ADN extracellulaire sera détectée. Depuis la formation de nouveaux filets est en quelque sorte altérée en présence d'Sytox, pour chaque point dans le temps un échantillon parallèle doit être utilisé.

3. NET de détection par immunomarquage

NET sont très fragiles, même après fixation et doivent être manipulés avec grand soin, sinon la majorité seront perdus lors de la préparation.

  1. Retirez délicatement lamelles de verre avec des cellules de la plaque attachée culture de 24 puits en le soulevant au bord d'une aiguille courbe et la saisir avec une pince fine. Mettez la lamelle à l'envers sur une goutte de PBS. Cela peut être fait sur une feuille de Parafilm couvrant un stand tube à essai. Laver comme celui-ci 3 fois pendant 5 min.
  2. Incuber lamelles de la même manière à une baisse de 0,5% de Triton X-100 pendant 1 min à température ambiante à perméabiliser les cellules. Laver 3 fois en PBS pendant 1 min.
  3. Préparer une chambre humide avec du parafilm et un tissu humide. Posez le couvercle glisse à l'envers sur une goutte de tampon de blocage (5% âne sérum) et incuber pendant 30 min à 37 ° C.
  4. Diluer anticorps primaires, par exemple la lutte contre Histon ms et RB anti-élastase neutrophile, en tampon de blocage.
  5. Transfert couvercle glisse dans la chambre humide directement à partir du tampon de blocage sur une goutte d'anticorps primaire et incuber pendant 1 h à 37 ° C.
  6. Lavez 3 fois pendant 5 min avec du PBS.
  7. Diluer anticorps secondaire, par exemple la lutte contre dk ms Cy2 et dk anti-rb Cy3, en tampon de blocage.
  8. Transfert couvercle se glisse dans la chambre humide sur une goutte d'anticorps secondaire et incuber pendant 1 h à 37 ° C.
  9. Lavez 3 fois pendant 5 min avec du PBS. Selon vos options de microscopie par fluorescence, l'ADN tache pendant 5 min, soit avec Hoechst 33342 (1 pg / ml), qui aura besoin d'excitation UV ou Draq5 pour l'excitation bien rouges et laver deux fois avec dist. de l'eau.
  10. Régler une baisse de Mowiol 20 pi sur une lame de verre et de monter des lamelles avec des cellules à l'envers. Les cellules doivent être entre la lamelle et la lame. La baisse de Mowiol va former une couche mince d'épaisseur homogène lorsque la lamelle est placée sur la goutte. Normalement, il n'ya pas besoin d'appuyer sur l'échantillon. Si vous voulez utiliser des lentilles non-immersion, l'échantillon est prêt pour l'inspection.Pour l'analyse microscopique avec des lentilles à immersion, laissez sécher le spécimen pendant environ 1 heure jusqu'à ce que le Mowiol a solidifié au bord de l'échantillon.

4. NET Préparation pour microscopie électronique à balayage (MEB)

  1. Message fixer les cellules sur les lamelles de verre de 24 puits plaque avec du glutaraldéhyde à 2,5%.
  2. Retirer des lamelles de verre contenant des cellules de la plaque de culture à 24 puits et de mettre à l'envers sur une goutte d'eau. Laver comme celui-ci 3 fois pendant 5 min.
  3. Transfert des lamelles de nouveau dans 24 puits, la plaque de culture cellulaire contenant 0,5% OsO4 et incuber pendant 30 min.
  4. Retirer des lamelles de verre contenant des cellules de la plaque de culture à 24 puits et de mettre à l'envers sur une goutte d'eau. Laver comme celui-ci 3 fois pendant 5 min.
  5. Transfert des lamelles de nouveau dans 24 puits, la plaque de culture cellulaire contenant 1% d'acide tannique et incuber pendant 30 min.
  6. Répétez les étapes 04/02 au 04/04
  7. Déshydrater à travers le schéma suivant (5min chacun):
    • 30% d'éthanol
    • 50% d'éthanol
    • 70% d'éthanol
    • 80% d'éthanol
    • Éthanol à 90%
    • 100% d'éthanol
    • 100% d'éthanol
    • 100% d'éthanol
  8. Transfert couvercle glisse dans sécheuse point critique et des échantillons secs.
  9. Manteau de la surface de spécimen avec 5nm platine / carbone calque à l'aide évaporateur à couche mince

5. Les résultats représentatifs:

La méthode d'isolement donne habituellement non stimulées neutrophiles viable avec une pureté supérieure à 95%. Lorsque fixé à différents moments après la stimulation, le protocole immunomarquage montre la séquence des changements morphologiques des cellules au cours NETosis aplatissement, une perte de lobules nucléaire, perte de granules et de l'intégrité noyau qui aboutit à un chevauchement croissant de l'énergie nucléaire (c'est à dire des histones) et granulaires (ie élastase neutrophile) coloration. Ce protocole peut servir de point de départ pour analyser les interactions spécifiques des pathogènes avec des neutrophiles. Cette interaction peut être disséqué de façon plus détaillée en utilisant le protocole de préparation pour la microscopie électronique à balayage.

NET fluorescence

Exemple de neutrophiles stimulés colorées pour NET (bleu = ADN, rouge = histones, vert = élastase neutrophile). Les images montrent, outre la localisation NET, la localisation nucléaire de l'ADN et les histones et le modèle granulaire pour l'élastase neutrophile.

SEM PMA de stimulation

Micrographie électronique à balayage montrant non neutrophiles stimulés et stimulés par PMA. Après stimulation, les neutrophiles s'aplatissent et produire NET.

NET SEM et Shigella

Une résolution plus élevée SEM image de bactéries Shigella piégés dans les filets.

Discussion

Le protocole doit permettre à l'isolement des non neutrophiles stimulés à la pureté considérable, l'induction de la formation nette et l'analyse des changements morphologiques au cours NETosis. Lors de la manipulation des échantillons avec soin, c'est à dire en évitant les difficiles conditions de lavage qui se traduira par la perte de la plupart des filets lâchement, le montant de la formation des NET dans des conditions de stimulation différentes (durée, relance) peuvent être comparés. À cet égard, les protocoles prévus peut servir comme point de départ pour établir des méthodes pour analyser les scénarios plus sophistiqués: l'interaction des neutrophiles / pathogène, la séquence de stimuli, interaction avec d'autres cellules immunitaires.

References

  1. Brinkmann, V. Neutrophil extracellular traps kill bacteria. Science. 303, 1532-1535 Forthcoming.
  2. Urban, C. F., Reichard, U., Brinkmann, V., Zychlinsky, A. Neutrophil extracellular traps capture and kill Candida albicans yeast and hyphal forms. Cell Microbiol. 8, 668-676 (2006).
  3. M, E. Leishmania amazonensis promastigotes induce and are killed by neutrophil extracellular traps. PNAS. 106, 6748-6753 (2009).
  4. Buchanan, J. T., Simpson, A. J., Aziz, R. K., Liu, G. Y., Kristian, S. A., Kotb, M., Feramisco, J., Nizet, V. DNase expression allows the pathogen group A Streptococcus to escape killing in neutrophil extracellular traps. Curr Biol. 14, 396-400 (2006).
  5. Fuchs, T. A. Novel cell death program leads to neutrophil extracellular traps. J Cell Biol. 176, 231-241 (2007).
  6. Brinkmann, V., Zychlinsky, A. Beneficial suicide: why neutrophils die to make NETs. Nat Rev Microbiol. 5, 577-582 (2007).
  7. Aga, E., Katschinski, D. M., van Zandbergen, G., Laufs, H., Hansen, B., Muller, K., Solbach, W., Laskay, T. Inhibition of the spontaneous apoptosis of neutrophil granulocytes by the intracellular parasite Leishmania major. J Immunol. 169-898 (2002).

Comments

27 Comments

  1. Hi,
    The protocol looks good for imaging- 1) how can you be sure if you are isolating only NETs but not also neutrophil ²) how intact are the NETs? 3) Is there a particular protocol for isolating only NETs? if not how hard is it?

    Reply
    Posted by: Anonymous
    June 16, 2010 - 8:19 AM
  2. Hi - the protocol is about isolating neutrophils and induce NET formation, not about NET isolation. If you fix NETs in the supernatant of stimulated neutrophils they are pretty intact. There is a protocol for isolation and quantification of NETs in Fuchs et al.

    Reply
    Posted by: Volker B.
    September 1, 2010 - 11:02 AM
  3. Hi! good day... how i can download this video? would you tell about this? i need to explain to my students...
    Thanks!

    Reply
    Posted by: Anonymous
    August 31, 2010 - 3:14 PM
  4. Please send us an email to support@jove.com

    Reply
    Posted by: Anonymous
    August 31, 2010 - 3:23 PM
  5. Sirs,
    This is a wonderful video on a hot subject. I will give a talk on our own work on NETS, and I would like to show the audience the way you prepare NETS. Could you permit me use your video in my talk?. If so, would you allow me to download the video?.Thank you very much.
    o. rojas-espinosa (rojas_espinosa@hotmail.com)

    Reply
    Posted by: Anonymous
    September 3, 2010 - 9:06 PM
  6. Hello from Greece,
    I am trying to follow your protocol and althought Imanaged to isolate the PMNs when I am trying to activate them with the pma I get results similar to the control group. I noticed that sytox has a toxic effect on the PMNs. Could you please tell me what is the concentration you are using? I would also like to ask you what is the Human Albumin serum you are using (cat no. and putity) and if you think I could use BSA cell culture tested instead.

    Ariana Gavriil, Ph.D.
    Immunology and Transplantation Center
    Foundation for Biomedical Research
    4 Soranou Ephessiou, 115 ²7
    Athens, Greece
    Tel.: +30²10 65 97 335, Fax.: +30²10 65 97 348

    Reply
    Posted by: Anonymous
    April 15, 2011 - 6:48 AM
  7. try to use 100nM of PMA from Molecular Probes

    Reply
    Posted by: Anonymous
    July 1, 2011 - 5:38 PM
  8. What a great video. Thank you very much. The idea to present video protocols is wonderful. Unfortunately, my university has no subscription. It seems to be too expensive. I think these kind of videos would save a lot of money being spent in unseccessful efforts. :)

    Do you think that NETs can bee seen in cytospins?
    After fixation of cells in Formalin or Methanol, what would be the reason for the fragility of NET structures?

    Reply
    Posted by: Anonymous
    February 17, 2012 - 6:55 AM
  9. Hello all,
    I am wanting to properly prepare and perform immunostaining (using primary and secondary antibodies) on a pus-filled clinical sample to determine the presence of neutrophil nets, complete with (hopefuly) organisms trapped/attached of "caught in the act" of biofilm growth. If anyone would be so kind, please share some insight on how to proceed with this idea. I know that I will have to be careful during collection and slide preparation as to keep any nets intact, and I know I will have to fix the slides somehow before I start the staining process. Everything else is beyond my knowledge. Any ideas on how to proceed?

    Reply
    Posted by: Anonymous
    March 3, 2012 - 11:06 AM
  10. Dear colleagues, thank you very much for sharing the experience.
    Could you tell me where did you obtain H²A-H²B-DNA complex antibody (they seems to be not commercial) or recommend some other anti Histone antibodies?

    Reply
    Posted by: Anonymous
    March 7, 2012 - 8:17 AM
  11. This is a novice Percoll user question. I prepared the percoll solutions with PBS as described under "1. PMN Isolation from human blood" step number 5. I made large enough volumes to prepare multiple gradients over a period of several days, and the solutions were stored @ 4C until needed. The first two neutrophil separations worked fine in that the RBCs pelleted as expected. The last two times resulted in incomplete pelleting of the RBCs leaving some left mixed in with the neutrophils. Should I be making fresh percoll solutions each time? Any other suggestions?

    Reply
    Posted by: M C.
    September 24, 2012 - 2:29 PM
  12. It is OK to store made up Percoll solutions at 4°C for some days or even weeks and the fact of storing them alone should not cause incomplete separation of the RBCs. The lowest band of PMN just above the RBC pellet often contains a larger portion of RBCs and can be omitted if you don't need the highest possible PMN count. If the RBC pellet dŒsn't form clearly at all there might still be something wrong with your solutions or the exact layering of the discontinuous gradient. First, try running the tubes longer to see if sedimentation was just slower than normal. There could also be causes in the preceding steps, so you might have to do more troubleshooting.

    Reply
    Posted by: Christian G.
    September 25, 2012 - 4:37 AM
  13. Thank you for your quick response and suggestions!

    Reply
    Posted by: M C.
    September 25, 2012 - 8:20 AM
  14. Thanks for the great video! In which step (if any) would it be possible to stop the protocol and continue the next day? Perhaps after fixing with the formaldehyde I could wash and store them overnight in PBS at 4C. I am trying to visualize NETs from mouse neutrophils collected from the bone marrow and just purifying the PMN takes half a day.

    Reply
    Posted by: Xavier R.
    November 21, 2012 - 12:23 PM
  15. Hi,thanks for your great video! It's very useful for me. I want to know whether the cover slips were lysinated before incubated neutrophils. Thank you !

    Reply
    Posted by: Yin X.
    June 25, 2013 - 9:00 AM
  16. We think it works best on glass slips that were not treated with polylysin.

    Reply
    Posted by: Christian G.
    June 25, 2013 - 11:25 AM
  17. But ,if not,how did neutrophils seed at slips stabe since they were not adherent cell?

    Reply
    Posted by: Yin X.
    June 25, 2013 - 11:34 AM
  18. Dear sir:
    For my experiment I am trying to isolate mature Neutrophils from peritoneal cavity of mice.
    Can you help me to answer my few questions please.

    How to prepare 3% thioglycollate broth?
    how many hours we should wait after injecting 3% thioglycollate to get mature neutrophils?

    Thank you
    Piya Patel

    Reply
    Posted by: Piya P.
    January 17, 2014 - 11:54 AM
  19. hi,

    Thank you for the protocol :) it is well explain !
    Have questions tough :
    -for fixation : you put the PFA within the media or do you first take it out then rinse with PBS then fix ?
    - can I fix and freeze the coverslip at -80°C to do the staining later ?
    - can I use mounting media with DAPI instead of staining DAPI then mounting ?

    Thank you very much !
    Anthony

    Reply
    Posted by: anthony l.
    May 6, 2014 - 12:56 PM
  20. Hi Anbthony,

    We put double concentrated PFA directly into the warm medium. Rinsing would destroy most of the NETs. Onced the specimens are fixed you can keep them for some time until staining. We never freeze them but keep them refrigerated after replacing the fixative with PBS (gently!). You can use DAPI-containing embedding media but we get less background when we wash the cells after DAPI staining.

    Good luck, Volker

    Reply
    Posted by: Volker B.
    May 7, 2014 - 9:52 AM
  21. Hi,

    Thank for the tips !
    It worked beautifully ;).
    I fixed with PFA as you explain, then wash 1x pbs carrefully Freeze them at -80°C and used mouting media with DAPI.
    PMA use : 600nM for 1h at 37°C.

    Thanks!
    anthony

    Reply
    Posted by: anthony l.
    May 15, 2014 - 8:22 AM
  22. Hi, I have a few questions regarding the isolation.
    Is it possible to isolate PMN's from buffy coat or is it only possible do this from Whole blood?
    How many PMN's is it possible to get if following this protocol? How much blood did you start with?
    Is it important to use 15 mL tubes when using both Histopaque and Percoll, or does it work with 50 mL tubes?

    Thank you in advance!
    Helena

    Reply
    Posted by: Helena E.
    May 20, 2014 - 9:31 AM
  23. Hi,
    is there a way to optimise for background-NET formation or in some instances false-positive results?

    Thank you

    Reply
    Posted by: Phili M.
    November 5, 2015 - 7:51 PM
  24. Hi Phili
    background NET formation in unstimulated PMN in my hands was a problem when seeding them without Serum. When seeded in RPMI with 0.5% human serum albumin added there was almost no background.
    Hth
    Christian

    Reply
    Posted by: Christian G.
    November 6, 2015 - 11:52 AM
  25. Hi Christian,

    Thank you for your quick reply. My additional question is which type of cover slip are you using for the assay (is it poly l lysine coated or uncoated)?

    Thank you

    Phili

    Reply
    Posted by: Phili M.
    November 6, 2015 - 10:06 PM
  26. Dear Phili
    we prefer plain glass coverslips. There is no need for making the glass more sticky and the PMN might react to the polylysine.
    Good luck
    Christian

    Reply
    Posted by: Christian G.
    November 9, 2015 - 10:06 AM
  27. Hi,
    I had some difficulties with the adherence of the Neutrophils to the cover-slips.
    Are your cover-slips made out of glass or plastics?
    Can you please indicate the brand of it.
    Thanks,
    Ariel

    Reply
    Posted by: Ariel O.
    March 30, 2016 - 10:06 AM

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