检索小鼠卵母细胞

Biology

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Summary

该协议说明了从小鼠的输卵管中提取卵母细胞或早期胚胎受精技术。能够识别infindibulum和钝年底针插入正确执行的程序是必不可少的。

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Duselis, A. R., Vrana, P. B. Retrieval of Mouse Oocytes. J. Vis. Exp. (3), e185, doi:10.3791/185 (2007).

Please note that all translations are automatically generated.

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Abstract

迄今为止,只有少数的研究报告Peromyscus胚胎发育或生殖生物学的成功操作。连同Peromyscus遗传联合中心(http://stkctr.biol.sc.edu),我们需要制定本系统的显着差异特征。一个主要目标,以优化的卵母细胞/早期胚胎的检索。

Protocol

胚胎/取卵

  1. 必须从-20 °解冻胚胎/卵母细胞的检索至少两个小时前,KSOM放置在37 ° C 2孵化器和FHM的。一个玻璃盘,其中包含三个凹浅水井是用来房子KSOM滴在孵化器。为了防止脱水,KSOM和菜都放置在有盖的容器,在底部的水。该仪器可以防止不使用矿物油的蒸发。

  2. 从排卵期女性输卵管被放置在FHM媒体。要确保的方向和一个完整的infindibulum,一个卵巢的一小部分被切断与子宫输卵管和一小部分。 30钝的针头是用来驱逐infindibulum钝针插入输卵管胚胎/卵母细胞。 infindibulum必须用于检索的胚胎,因为输卵管通过针管太小。 infindibulum是在破坏事件,输卵管必须切片打开或胚胎挤掉。

  3. 在FHM的媒体集中在培养皿的底部有沉没的脂肪滴在显微镜,胚胎/卵母细胞。胚胎/卵母细胞隔离可以实现,因为这提供了更大的可视面积比高倍率在20倍。胚胎/卵母细胞看起来像一轮脂肪滴,它周围有一个明确的环。口移液,用一把拉住玻璃毛细管,用于移动胚胎/卵母细胞,孵化和进一步操纵KSOM。

取卵的程序

制备

  1. 解冻FHM杂志和准备KSOM。
  2. 几个小时前,放置在容器中,提示框放置在底部的水二氧化碳培养箱取卵KSOM 。
  3. 笼实验室和杀死收获的女性。
  4. 剪下输卵管被小心地削减一些卵巢和子宫,以确保你不切断输卵管的一部分。
  5. 小培养皿放置在FHM的媒体。
  6. 倒入一对夫妇更FHM杂志媒体的Petri用于冲厕的菜。

法拉盛

  1. 使用螺旋年底到1毫升针连接冲洗针(规格30冲服)。
  2. 的时间和使用针输卵管,左连接部分卵巢附近发现漏斗插入。如果漏斗被破坏,无法使用,然后采取两个钳,保持输卵管的一端。其他forcep,轻轻挤压,像牙膏,弹出任何胚胎的。

    注:这将创建一个在培养皿中的大量乱七八糟的,很多组织将用它来 ​​,所以你可能要使用不同的培养皿中,事后。

  3. 看到胚胎,脂肪件重点放在显微镜和一轮的“一块肥肉”,围绕它的清晰的圆圈。

    注:胚胎有相同的外观为脂肪,因此它可能很难找到。胚胎沉底,所以在那里寻找。

  4. 受援国女性阴道细胞涂片。在这个阶段,他们应该是假孕。

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Discussion

在这篇文章中,我们展示了从排卵诱导(超排)Peromyscus的卵母细胞的检索。利用超数排卵(相对于自然发情周期)是常见的,由于导致数字更大。然而,必须采取谨慎解释结果,利用这样的卵母细胞/胚胎,激素用于诱导排卵和培养可能有特效。

当发情已证实,女性euthenized和输卵管与卵巢的一小部分一起回收。卵巢小区域被用作infindibulum的位置的标记。 infindibulum坐在旁边卵巢,经常通过组织一层薄薄的预测。在这个组织的另一边,其余的输卵管是盘绕,并最终导致进入阴道。最好是通过infindibulum推液中提取的卵母细胞。这个方向是必要的,因为一个单向阀,位于阴道输卵管接口。如果他们通过阀门向后预计可能受到伤害的卵母细胞。

一个30 gaugle钝年底针插入到infindibulum。钝针会适合infindibulum开放,但不适合进入输卵管管。因此,必须小心,以确保infindibulum是不是在解剖或取卵损坏。如果infindibulum被破坏,输卵管管可以通过钳挤压允许任何被困的卵母细胞退出。

假设是在发情期,女性的生殖器官有一个红色的外观,由于血液供应增加,并出现浮肿。我们观察到,在两只鹿鼠种的差异测试:P. polionotus了很多油腻的卵巢和输卵管比体育maniculatus,使取卵更加困难。

一旦从输卵管的卵母细胞取出,他们在低倍率的光学显微镜可观察到。查看在一个较低的放大倍率的卵母细胞,允许用户快速扫描培养皿。显微镜应侧重于底层的脂肪颗粒。卵母细胞会看起来像一个明确环外绕浑圆的脂肪颗粒。为了帮助检测的卵母细胞,尝试调整投射光线通过培养皿。此外,如果培养皿轻轻动摇的卵母细胞不会移动相比,脂肪滴。这些提示可以帮助新手研究者找到的卵母细胞,但是,它很可能多次试验将是必要的的,前一个是舒适的程序。

分离出卵母细胞,可用于多种,包括生产干细胞系,嵌合体的生产,或遗传操作的实验。虽然我们已经发现相当大的差异,在诱发排卵所需的参数和时序检索的一般方法应该适用于许多啮齿类动物(鹿鼠〜30亿年从实验小鼠和大鼠分歧)。我们特别希望,这将有利于那些在小说这种技术不能很好地建立了系统的工作。

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Acknowledgements

我想感谢他的帮助,耐心和知识迈克杜威Peromyscus遗传库存中心。

Materials

Name Type Company Catalog Number Comments
Flushing needle Tool Zephyrtronics ZT5-130-L 30 gauge blunt
Forceps (2) Tool Roboz Surgical Instruments Co. RS-5060
Peromyscus Animal Peromyscus Genetic Stock Center
Scissors Tool Roboz Surgical Instruments Co. RS-5880
FHM HEPES Buffered Media Reagent Specialty Media MR-025-d
KSOM Embryo Culture Medium (5x10 ml) Reagent Specialty Media MR-020P-5F
Mouth Pipette Tool Pulled from glass capillaries and attached to rubber tubing
Oocyte holding dish Tool Glass container with concave divets

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Comments

3 Comments

  1. hi Amanda! i'm Anna from the Ken Cho lab here at UCI.  i'm starting work with mouse blastocysts (e3.5, e4.5), & i'm hoping you can give me advice on how to handle them?  i'm able to successfully Xgal stain blastocysts, but by the end of the procedure, then look "flattened" so i can't really discern where the Xgal staining is localized.  how do i maintain the round morphology?  and how do you fix your blastocysts?

    Reply
    Posted by: Anonymous
    October 17, 2008 - 4:08 PM
  2. what is flushing needle?

    Reply
    Posted by: Anonymous
    October 27, 2008 - 5:41 AM
  3. hi
    i request to view this video

    Reply
    Posted by: arun m.
    September 9, 2009 - 5:50 AM

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