Быстрое однородных Обнаружение биологических экспериментов с использованием магнитных система биодатчиков модуляции

Biology

Your institution must subscribe to JoVE's Biology section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

Welcome!

Enter your email below to get your free 10 minute trial to JoVE!





We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.

If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.

 

Summary

Магнитная система модуляции биодатчиков используется для быстрого, чутко и просто обнаруживать биологические анализы, такие как молекулы ДНК и белков.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Danielli, A., Porat, N., Ehrlich, M., Arie, A. Rapid Homogeneous Detection of Biological Assays Using Magnetic Modulation Biosensing System. J. Vis. Exp. (40), e1935, doi:10.3791/1935 (2010).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Модуляции магнитного биодатчиков системы (ММБ) [1,2] быстро и равномерно обнаружено биологических мишеней при низких концентрациях без мытья или стадии разделения. Когда IL-8 целевых присутствовал, "sandwich' основе анализа прилагается магнитных шариков с IL-8 захвата антитела к стрептавидин связаны флуоресцентного белка с помощью IL-8 цели и биотинилированного IL-8 антител. Магнитного бисер маневрировал в колебательное движение, применяя переменного градиента магнитного поля с помощью двух электромагнитных полюсов. Флуоресцентные белки, которые прилагаются к магнитных шариков конденсируются в области обнаружения и их движение в и из ортогональных лазерный луч производит периодические флуоресцентный сигнал, демодулированный использованием синхронного детектирования. Магнитная система биодатчиков модуляции ранее был использован для выявления кодирующих последовательностей из неструктурных Ибараки вирусного белка 3 (NS3) комплементарной ДНК (кДНК) [2]. Методы, которые демонстрируются в этой работе для внешних манипуляций и конденсации частиц могут быть использованы для других применений, например, поставка магнитно-связанных наркотиков

Protocol

ИЛ-8 анализа:

  1. Реакционной смеси включены следующие четыре компонента в 100 мкл конечного объема буфера в соответствующих концентрациях. 10 мкл магнитных шариков с захватом антител при 100 бусин / мкл конечных концентрациях, 2 мкл биотинилированного IL-8 антител на 1 nano-gram/μl конечной концентрации, 1 мкл стрептавидин флуоресцентного белка при 20 nano-gram/μl конечной концентрации, и 1 мкл IL-8 цель на 0,48 pico-gram/μl. Компоненты добавляются один за другим буфером и затем встряхивают в течение 30 минут.
  2. Контрольной реакции готовят так же, без IL-8 цели.
  3. Реакции позже помещен без каких-либо разделения или стиральную шаг в кювет и проверить при помощи MMB системы.

MMB системы:

  1. Место кювету в его положение между двумя электромагнитными полюсами.
  2. Эксплуатация модуляции тока и подождите 30 секунд, чтобы позволить агрегации и конденсации бисером
  3. Измерить сигнал синхронный усилитель с помощью осциллографа.

Представитель Результаты:

Визуальный осмотр агрегированных бисером представили четкое различие между реакцией с мишенью и реакции без цели. Во всех реакциях с мишенью, бусин формируется единый плотный агрегат, который переехал в и из лазерного луча таким образом, объединиться. Однако во всех реакции без цели, бусины были менее агрегированных и их движение было менее объединиться (см. Рисунок 1).

Рисунок 1
Рисунок 1: визуальный осмотр иммуноанализа сэндвич '() без целевой ИЛ-8 (б) с целевой IL-8.

Часы полюс модуляции (желтый) и PMT выходного сигнала (пурпурный) при обнаружении 0,48 грамма пико-IL-8 целевых представлены на рисунке 1 (а). Частота модуляции для каждого полюса с частотой 2 Гц. Однако, как это было теоретически ожидать, когда бусины проходит лазерный луч, PMT обнаруживает флуоресцентный свет, и есть пик в PMT выходного напряжения. Таким образом, демодуляция частоты с частотой 4 Гц. Когда ФЭУ сигнал и удвоил-модуляции частоты (с частотой 4 Гц) подают к замку усилителем, чувствительным детектором фазы обнаруживает синхронизации и результатов с высоким напряжением (см. Рисунок 2).

Рисунок 2
Рисунок 2: (а) модуляции часы (желтый) и ФЭУ сигнал (пурпурный) при обнаружении 0,48 грамма пико-IL-8 цели. (Б) привели блокировки усилитель напряжения на двух разных сканов.

Замок в усилителе не обнаружили никакого сигнала, когда контрольный образец был испытан. Этот факт, вместе с визуальной разницы в агрегации показывает, что система MMB может точно определить присутствие ИЛ-8 цели.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Таким образом, мы показали, что система MMB может быть использован для обнаружения присутствия IL-8 целевой при низких концентрациях (0,5 пико грамм предел обнаружения Bio-Plex Precision Pro анализах цитокинов [3,4]). Способность системы не ограничивается IL-8 и может быть использован для обнаружения других белков. Преимущества системы MMB являются способность обнаруживать цель быстро и без каких-либо отделения или промывки. Таким образом, это облегчает процесс обнаружения и позволяет системе, которые будут использоваться в полевых условиях.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Acknowledgements

Эта работа была частично поддержана Ishaya Горовиц фонд.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Bio-Plex Pro Human Cytokine IL-8 set Bio-Rad 171-B5008M
Recombinant human IL-8 target Thermo Fisher Scientific, Inc. R202625
Biotinylated monoclonal mouse anti human IL-8 antibody G265-8 BD Biosciences 554718
Streptavidin coupled fluorescent protein Bio-Rad Streptavidin PE

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Danielli, A., Arie, A., Porat, N., Ehrlich, M. Detection of fluorescent-labeled probes at sub-picomolar concentrations by magnetic modulation. Optics Express. 16, 19253-19259 (2008).
  2. Danielli, A., Porat, N., Arie, A., Ehrlich, M. Rapid homogenous detection of the Ibaraki virus NS3 cDNA at pico-molar concentrations by magnetic modulation. Biosensors and Bioelectronics. 25, 858-863 (2009).
  3. Bio-Rad "Human angiogenesis assay panel". Bio-Plex Pro. Forthcoming.
  4. Instruction Manual. Bio-Plex Precision Pro Cytokine Assay. Bio-Rad Laboratories. Hercules, CA. Forthcoming.

Comments

2 Comments

  1. In regards to the IL-8 Assay: [1] Did you have a specific concentration values on hand? [²] Is there a specific pH range that you used? [3] How did you optimize so that the target antigen would bind to both the magnetic bead and the fluorescent protein?

    Reply
    Posted by: Anonymous
    August 19, 2010 - 2:26 PM
  2. Hi Michael,
    Here are the answers to your questions:
    [1] Did you have a specific concentration values on hand?

    We made several concentrations according to the Bio-Rad kit that we used. We chose to present the results with the smallest concentration that we made.

    [²] Is there a specific pH range that you used?

    We used the assay buffer of the kit. I guess that it had the optimal ph for the reaction.

    [3] How did you optimize so that the target antigen would bind to both the magnetic bead and the fluorescent protein?

    This kit is optimized already. You may check the reference list of the JoVE manuscript and see the kit&#x²019;s specifications. For further information on the MMB system as well as on the IL-8 kit, I suggest that you look at additional paper that we published: A. Danielli, N. Porat, M. Ehrlich, and A. Arie, &#x²01C;Magnetic modulation biosensing for rapid and homogeneous detection of biological targets at low concentrations&#x²01D;, Current Pharmaceutical Biotechnology, 11, 1²8-137 (²010)

    Best regards,

    Amos Danielli

    Reply
    Posted by: Amos D.
    November 2, 2010 - 3:44 PM

Post a Question / Comment / Request

You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

Usage Statistics