متجانسة الكشف السريع عن طريق فحوصات البيولوجي المغناطيسي نظام Biosensing التحوير

Biology

Your institution must subscribe to JoVE's Biology section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

Welcome!

Enter your email below to get your free 10 minute trial to JoVE!





We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.

If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.

 

Summary

ويستخدم نظام مغناطيسي لتعديل biosensing بسرعة ، بحساسية وبساطة كشف المقايسات البيولوجية ، مثل جزيئات الحمض النووي والبروتينات.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Danielli, A., Porat, N., Ehrlich, M., Arie, A. Rapid Homogeneous Detection of Biological Assays Using Magnetic Modulation Biosensing System. J. Vis. Exp. (40), e1935, doi:10.3791/1935 (2010).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

نظام مغناطيسي biosensing التعديل (MMB) [1،2] بسرعة والكشف عن الأهداف الحيوية بشكل متجانس في تركيزات منخفضة دون أي خطوة الغسيل أو الانفصال. عندما IL - 8 الهدف كان حاضرا ، وهو 'sandwich' المستندة إلى مقايسة المرفقة مع الخرز المغناطيسي IL - 8 القبض على الضد streptavidin بروتين فلوري جانب طريق مستهدفة IL - 8 و IL - 8 biotinylated الأضداد. وناور حبات المغناطيسي في حركة متذبذبة من خلال تطبيق المجال المغناطيسي بالتناوب التدرج من خلال قطبين الكهرومغناطيسي. ومكثف البروتينات الفلورية ، والتي تعلق على حبات المغناطيسي في المنطقة والكشف عن تحركاتهم داخل وخارج لشعاع الليزر متعامد تنتج إشارة الدوري الفلورسنت التي يتم الكشف demodulated باستخدام متزامن. كان يستخدم سابقا biosensing تعديل النظام المغناطيسي للكشف عن تسلسل الترميز للبروتين الفيروس غير الهيكلية ايباراكي 3 (NS3) DNA التكميلية ([كدنا]) [2]. ويمكن استخدام التقنيات التي أثبتت في هذا العمل الخارجي للتلاعب والتكثيف من الجزيئات لتطبيقات أخرى ، مثل تسليم المخدرات ، إلى جانب مغناطيسيا

Protocol

IL - 8 مقايسة :

  1. وشملت خليط التفاعل المكونات الأربعة التالية من حيث الحجم النهائي 100 ميكرولتر من مقايسة العازلة في تركيزات كل منهما. 10 ميكروليتر من الخرز المغناطيسي مع الأضداد في التقاط حبات 100 / ميكرولتر تركيزات النهائي ، و 2 ميكرولتر من IL - 8 biotinylated الأضداد في التركيز النهائي nano-gram/μl 1 ، 1 ميكرولتر من بروتين فلوري streptavidin بتركيز 20 nano-gram/μl النهائي ، و 1 ميكرولتر من IL - 8 المستهدف عند 0.48 pico-gram/μl. تضاف المكونات واحدا تلو الآخر إلى المخزن المؤقت مقايسة واهتزت لمدة 30 دقيقة ثم.
  2. ويتم إعداد رد فعل السيطرة على نفس الطريق دون أن يكون الهدف IL - 8.
  3. يتم وضعها في وقت لاحق من دون أي ردود فعل الانفصال أو خطوة الغسيل في cuvettes وتفتيشها باستخدام نظام MMB.

MMB النظام :

  1. ضع كفيت في موقفه بين القطبين الكهرومغناطيسي.
  2. العمل الحالي التشكيل وانتظر 30 ثانية للسماح التجميع والتكثيف من الخرز
  3. قياس إشارة القفل في مكبر للصوت باستخدام الذبذبات.

ممثل النتائج :

قدم الفحص البصري من الخرز المجمعة فرق واضح بين التفاعل مع الهدف والتفاعل من دون هدف. في ردود الفعل على كل شيء مع هذا الهدف ، شكلت الخرز واحد ، التجميعية الكثيفة التي انتقلت من وإلى شعاع الليزر بطريقة توحد. ومع ذلك ، في رد فعل كل ذلك من دون هدف ، كانت حبات أقل مجمعة وحركتهم كان أقل توحيد (انظر الشكل 1).

الشكل 1
الشكل 1 : التفتيش البصري المناعية الساندويتش "(أ) دون هدف IL - 8 (ب) والهدف IL - 8.

وتعرض على مدار الساعة التشكيل قطب (الصفراء) وإشارة الناتج PMT (أرجواني) ، في حين كشف 0.48 بيكو غرام IL - 8 المستهدفة في الشكل 1 (أ). تردد التحوير لكل قطب هو في 2 هرتز. لكن ، وكما كان متوقعا من الناحية النظرية ، عند حبات تمرير شعاع ليزر ، ويكشف PMT ضوء الفلورسنت وهناك قمة في انتاج التيار الكهربائي PMT. لذلك ، تردد هو الإستخلاص في 4 هرتز. عندما يتم تغذية إشارة PMT وعلى مدار الساعة ، تضاعف التعديل (في 4 هرتز) للقفل في مكبر للصوت ، في مرحلة حساسة للكشف عن بالكشف عن التزامن والنتائج مع الجهد العالي (انظر الشكل 2).

الشكل 2
الشكل 2 : (أ) على مدار الساعة التشكيل (الأصفر) ، وإشارة PMT (أرجواني) عند الكشف 0.48 بيكو غرام IL - 8 المستهدفة. (ب) وتأمين التيار الكهربائي أدى إلى مكبر للصوت على اثنين من يمسح مختلفة.

لم القفل في مكبر للصوت لا يكشف عن أي إشارة عندما تم اختبار عينة السيطرة. هذه الحقيقة ، جنبا إلى جنب مع الفرق البصرية في التجميع تشير إلى أن نظام MMB يمكن تحديد واضح لوجود IL - 8 المستهدفة.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

باختصار ، لقد أظهرنا أنه يمكن استخدام هذا النظام MMB للكشف عن وجود IL - 8 هدف في تركيزات منخفضة (0.5 بيكو غرام هو الحد من الكشف عن فحوصات دقيقة بيو برو خلوى الصفيف [3،4]). لا يقتصر على قدرة النظام على IL - 8 ، ويمكن استخدامها للكشف عن البروتينات الأخرى. مزايا نظام MMB هي القدرة على كشف الهدف بسرعة ودون أي خطوة الانفصال أو الغسيل. وبالتالي ، تسهل عملية الكشف ويسمح استخدام هذا النظام في التطبيقات الميدانية.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Acknowledgements

وأيد هذا العمل جزئيا من صندوق هورويتز إيشايا.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Bio-Plex Pro Human Cytokine IL-8 set Bio-Rad 171-B5008M
Recombinant human IL-8 target Thermo Fisher Scientific, Inc. R202625
Biotinylated monoclonal mouse anti human IL-8 antibody G265-8 BD Biosciences 554718
Streptavidin coupled fluorescent protein Bio-Rad Streptavidin PE

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Danielli, A., Arie, A., Porat, N., Ehrlich, M. Detection of fluorescent-labeled probes at sub-picomolar concentrations by magnetic modulation. Optics Express. 16, 19253-19259 (2008).
  2. Danielli, A., Porat, N., Arie, A., Ehrlich, M. Rapid homogenous detection of the Ibaraki virus NS3 cDNA at pico-molar concentrations by magnetic modulation. Biosensors and Bioelectronics. 25, 858-863 (2009).
  3. Bio-Rad "Human angiogenesis assay panel". Bio-Plex Pro. Forthcoming.
  4. Instruction Manual. Bio-Plex Precision Pro Cytokine Assay. Bio-Rad Laboratories. Hercules, CA. Forthcoming.

Comments

2 Comments

  1. In regards to the IL-8 Assay: [1] Did you have a specific concentration values on hand? [²] Is there a specific pH range that you used? [3] How did you optimize so that the target antigen would bind to both the magnetic bead and the fluorescent protein?

    Reply
    Posted by: Anonymous
    August 19, 2010 - 2:26 PM
  2. Hi Michael,
    Here are the answers to your questions:
    [1] Did you have a specific concentration values on hand?

    We made several concentrations according to the Bio-Rad kit that we used. We chose to present the results with the smallest concentration that we made.

    [²] Is there a specific pH range that you used?

    We used the assay buffer of the kit. I guess that it had the optimal ph for the reaction.

    [3] How did you optimize so that the target antigen would bind to both the magnetic bead and the fluorescent protein?

    This kit is optimized already. You may check the reference list of the JoVE manuscript and see the kit&#x²019;s specifications. For further information on the MMB system as well as on the IL-8 kit, I suggest that you look at additional paper that we published: A. Danielli, N. Porat, M. Ehrlich, and A. Arie, &#x²01C;Magnetic modulation biosensing for rapid and homogeneous detection of biological targets at low concentrations&#x²01D;, Current Pharmaceutical Biotechnology, 11, 1²8-137 (²010)

    Best regards,

    Amos Danielli

    Reply
    Posted by: Amos D.
    November 2, 2010 - 3:44 PM

Post a Question / Comment / Request

You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

Usage Statistics