자기 변조 Biosensing 시스템을 사용하여 생물 학적 Assays의 급속한 동차 검색

Biology

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Summary

자기 변조 biosensing 시스템은 빠르게, sensitively 단순히 같은 DNA 분자와 단백질과 같은 생물 학적 assays를 감지하는 활용됩니다.

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Danielli, A., Porat, N., Ehrlich, M., Arie, A. Rapid Homogeneous Detection of Biological Assays Using Magnetic Modulation Biosensing System. J. Vis. Exp. (40), e1935, doi:10.3791/1935 (2010).

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Abstract

자기 변조 biosensing 시스템 (MMB) [1,2] 빠르게하고 세척 또는 분리 단계없이 낮은 농도에서 homogeneously 감지 생물 학적 대상으로하고 있습니다. IL - 8 목표는 현재의 때, 'sandwich' 기반 분석은 IL - 8 대상과 biotinylated IL - 8 항체 결합을 통해 형광 단백질을 streptavidin하는 IL - 8 캡처 항체와 자기 구슬을 첨부. 자석 구슬은 두 개의 전자 기둥을 통해 교류 자기장 기울기를 적용하여 oscillatory 모션으로 였는데 있습니다. 자석 구슬에 연결된 형광 단백질은 직교 레이저 빔을 동기 검출을 사용 복조된하는 정기 형광 신호를 생산에서 퇴원 감지 영역과 운동으로 응축됩니다. 자기 변조 biosensing 시스템은 이전에 비 구조 이바라키 바이러스 단백질 3 (NS3) 보완 DNA (cDNA) [2]의 코드 시퀀스를 검색하는 데 사용되었다. 입자의 외부 조작 및 응축이 작품 시연되는 기술은 다른 응용 프로그램, 자기 (磁 气) - 결합 약물의 예를 들어 전달에 사용할 수 있습니다

Protocol

IL - 8 검정 :

  1. 각각의 농도의 분석 완충액 100 μl 최종 볼륨의 반응 혼합물은 다음 네 가지 구성 요소가 포함되어 있습니다. 100 구슬 / μl 최종 농도 1 nano-gram/μl 최종 농도에 biotinylated IL - 8 항체 2 μl, 20 nano-gram/μl 최종 농도에 streptavidin 형광 단백질의 1 μl에서 캡처 항체와 자석 구슬 10 μl 0.48 pico-gram/μl에서 IL - 8 대상의 1 μl. 구성 요소 분석 버퍼를 하나씩 추가하고 30 분 흔들리고 있습니다.
  2. 제어 반응은 IL - 8 대상없이 동일한 방식으로 준비가되어 있습니다.
  3. 반응은 나중에 cuvettes에서 분리 또는 세척 단계없이 배치와 MMB 시스템을 사용하여 검사하고 있습니다.

MMB 시스템 :

  1. 두 전자기 채를 사이의 위치에 쿠베트를 놓습니다.
  2. 변조 전류를 운영하고 구슬의 집합과 결로 수 있도록 30 초 기다
  3. 잠금 기능 증폭기 오실로 스코프를 사용하는 신호를 측정합니다.

대표 결과 :

집계 비즈의 육안 검사는 대상과 함께 반응과 목표없이 반응 사이에 뚜렷한 차이를 발표했다. 대상 모든 반응에서 구슬이 단결의 방식으로 레이저 빔을에서 이사 단일 고밀도 집적을 형성. 그러나, 대상없이 모든 반응에 구슬이 적게 집계되었으며 그들의 움직임은 (그림 1 참조) 덜 단결했습니다.

그림 1
그림 1 : 목표없이 샌드위치 '면역 분석법의 육안 검사 (A) IL - 8의 대상 IL - 8 (B).

극 변조 시계 (노란색)와 PMT 출력 신호 (마젠타) 0.48 피코 그램 - IL - 8 목표를 감지하는 동안은 (A) 그림 1에서 제공됩니다. 각 극에 대한 변조 주파수 2 Hz에서에 있습니다. 그러나, 그것이 이론적으로 예상되면서, 구슬이 레이저 광선을 통과하면 PMT는 형광등을 감지하고 PMT 출력 전압의 피크가 있습니다. 따라서 복조 주파수는 4 Hz에서에 있습니다. PMT 신호와 두 - 변조 시계 (4 Hz에서에서) 증폭기의 잠금을 먹이로하는 경우, 민감한 위상 검출기는 동기화 및 고전압 (그림 2 참조) 결과를 감지합니다.

그림 2
그림 2 : (A) 변조 시계 (노란색)와 PMT 신호 (마젠타) 감지 0.48 피코 그램 - IL - 8 타겟팅할 수 있습니다. 두 가지 검사에서 증폭기 전압에서 (B) 결과 잠금.

증폭기의 잠금 제어 샘플을 테스트되었습니다 어떤 신호를 감지하지 않았다. 이 사실은 함께 집합의 시각 차이와 MMB 시스템이 명확하게 IL - 8 대상의 존재를 확인할 수 제안합니다.

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Discussion

요약, 우리는 MMB 시스템이 낮은 농도 (0.5 피코 - g가 [3,4] 바이오 플렉스 정밀 프로 시토킨 assays의 검출 한계입니다)에서 IL - 8 대상의 존재를 감지하는 데 사용할 수있는 것으로 나타났다. 시스템의 기능은 IL - 8에 국한되지 않으며 다른 단백질을 탐지하는 데 사용할 수 있습니다. MMB 시스템의 장점은 빠른 속도로 및 분리 또는 세척 단계없이 목표물을 감지하는 능력입니다. 따라서, 그것은 검색 프로세스를 용이하게하고 시스템을 현장 애플 리케이션에서 사용할 수 있습니다.

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Acknowledgements

이 작품은 일부 Ishaya 호로비츠 기금에 의해 지원되었다.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Bio-Plex Pro Human Cytokine IL-8 set Bio-Rad 171-B5008M
Recombinant human IL-8 target Thermo Fisher Scientific, Inc. R202625
Biotinylated monoclonal mouse anti human IL-8 antibody G265-8 BD Biosciences 554718
Streptavidin coupled fluorescent protein Bio-Rad Streptavidin PE

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Danielli, A., Arie, A., Porat, N., Ehrlich, M. Detection of fluorescent-labeled probes at sub-picomolar concentrations by magnetic modulation. Optics Express. 16, 19253-19259 (2008).
  2. Danielli, A., Porat, N., Arie, A., Ehrlich, M. Rapid homogenous detection of the Ibaraki virus NS3 cDNA at pico-molar concentrations by magnetic modulation. Biosensors and Bioelectronics. 25, 858-863 (2009).
  3. Bio-Rad "Human angiogenesis assay panel". Bio-Plex Pro. Forthcoming.
  4. Instruction Manual. Bio-Plex Precision Pro Cytokine Assay. Bio-Rad Laboratories. Hercules, CA. Forthcoming.

Comments

2 Comments

  1. In regards to the IL-8 Assay: [1] Did you have a specific concentration values on hand? [²] Is there a specific pH range that you used? [3] How did you optimize so that the target antigen would bind to both the magnetic bead and the fluorescent protein?

    Reply
    Posted by: Anonymous
    August 19, 2010 - 2:26 PM
  2. Hi Michael,
    Here are the answers to your questions:
    [1] Did you have a specific concentration values on hand?

    We made several concentrations according to the Bio-Rad kit that we used. We chose to present the results with the smallest concentration that we made.

    [²] Is there a specific pH range that you used?

    We used the assay buffer of the kit. I guess that it had the optimal ph for the reaction.

    [3] How did you optimize so that the target antigen would bind to both the magnetic bead and the fluorescent protein?

    This kit is optimized already. You may check the reference list of the JoVE manuscript and see the kit&#x²019;s specifications. For further information on the MMB system as well as on the IL-8 kit, I suggest that you look at additional paper that we published: A. Danielli, N. Porat, M. Ehrlich, and A. Arie, &#x²01C;Magnetic modulation biosensing for rapid and homogeneous detection of biological targets at low concentrations&#x²01D;, Current Pharmaceutical Biotechnology, 11, 1²8-137 (²010)

    Best regards,

    Amos Danielli

    Reply
    Posted by: Amos D.
    November 2, 2010 - 3:44 PM

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