磁気変調バイオセンシングシステムを用いた生物学的アッセイの迅速な均質な検出

Biology

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Summary

磁気変調バイオセンシングシステムを迅速に、敏感にそして単純にそのようなDNA分子やタンパク質などの生物学的アッセイを、検出するために利用されている。

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Danielli, A., Porat, N., Ehrlich, M., Arie, A. Rapid Homogeneous Detection of Biological Assays Using Magnetic Modulation Biosensing System. J. Vis. Exp. (40), e1935, doi:10.3791/1935 (2010).

Please note that all translations are automatically generated.

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Abstract

磁気変調バイオセンシングシステム(MMB)[1,2]は、急速かつ均一にいかなる洗浄または分離工程を行うことなく、低濃度で生物学的標的を検出する。 IL - 8ターゲットが存在していたときに、"sandwich'ベースのアッセイは、IL - 8ターゲットとビオチン化IL - 8抗体を介して結合蛍光タンパク質をストレプトアビジンに、IL - 8のキャプチャー抗体と磁気ビーズを装着。磁気ビーズは、2つの電磁極を介して交流磁場勾配を印加することにより振動運動に操縦されています。直交するレーザビームの内と外蛍光磁性ビーズに結合されているタンパク質、検出領域に凝縮され、その動きは、同期検波を使用して復調される周期的な蛍光シグナルを生成します。磁気変調バイオセンシングシステムは、以前は次の相補的DNA(cDNA)[2]非構造茨城ウイルスタンパク質3(NS3)のコード配列を検出するために使用されていました。粒子の外部操作や結露のためにこの作品で実証されている技術は、他のアプリケーション、磁気的に結合された薬物の例:配送のために使用することができます

Protocol

IL - 8アッセイ:

  1. 反応混合物は、それぞれの濃度でアッセイバッファー100μlの最終容量に次の4つのコンポーネントが含まれています。 100ビーズ/μlの最終濃度が、1nano-gram/μl最終濃度ビオチン化IL - 8抗体を2μl、20nano-gram/μl最終濃度でストレプトアビジン蛍光タンパク質を1μl、で捕捉抗体と磁気ビーズを10μlの0.48pico-gram/μlにおけるIL - 8ターゲットのと1μL。コンポーネントは、アッセイバッファーに1つずつ追加され、その後30分間振とうされています。
  2. コントロール反応は、IL - 8ターゲットすることなく、同じ方法を用意しています。
  3. 反応は後でキュベット内の任意の分離または洗浄工程なしで配置され、MMBシステムを使用して検査されます。

MMBシステム:

  1. 2つの電磁極の間にその位置でキュベットを置きます。
  2. 変調電流を操作し、ビーズの凝集や凝縮を可能にするために30秒待って
  3. ロックインアンプ、オシロスコープを使っての信号を測定します。

代表的な結果:

集約されたビーズの目視検査では、ターゲットとの反応とターゲットすることなく反応の間に明確な違いを示した。ターゲットを持つすべての反応においては、ビーズは団結の方法で、レーザービームで出入りシングル、密な集合体を形成した。しかし、ターゲットのないすべての反応において、ビーズは小さく、集約し、それらの動きは(図1を参照)団結以下であった。

図1
図1:ターゲットのIL - 8を使用してターゲットのIL - 8(B)のないサンドイッチ"免疫測定法の目視検査()。

ポール変調クロック(黄色)とPMTの出力信号(マゼンタ)0.48ピコグラムのIL - 8ターゲットを検出しながら、図1(a)に示されている。各極の変調周波数は2 Hzになります。しかし、それは理論的に予想されたように、ビーズは、レーザービームを通過するとき、光電子増倍管は蛍光灯を検出し、PMT出力電圧のピークがある。従って、復調周波数は4 Hzになります。 PMT信号と倍増変調クロックが(4 Hzで)アンプでロックに供給されると、敏感な位相検出器は高電圧に同期して結果を検出し(図2を参照)。

図2
図2:(a)は変調クロック(黄色)とPMT信号(マゼンタ)検出0.48ピコグラムのIL - 8ターゲット。 (b)二つの異なるスキャンでのアンプの電圧になったロック。

アンプのロックは、コントロールサンプルがテストされた任意の信号が検出されませんでした。この事実は、一緒に凝集における視覚的な違いとMMBシステムが明らかにIL - 8ターゲットの存在を識別することができることを示唆している。

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Discussion

要約すると、我々は、MMBのシステムが低濃度(0.5ピコ- gramのは[3,4]バイオプレックスプレシジョンプロサイトカインアッセイの検出限界である)でIL - 8ターゲットの存在を検出するために使用できることを示した。システムの能力は、IL - 8に限定されず、他のタンパク質を検出するために使用することができます。 MMBシステムの利点は、急速に、任意の分離または洗浄工程なしでターゲットを検出する機能です。したがって、検出プロセスを容易にし、システムがフィールドアプリケーションで使用することができます。

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Acknowledgements

本研究の一部はIshayaホロヴィッツ基金によってサポートされていました。

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Bio-Plex Pro Human Cytokine IL-8 set Bio-Rad 171-B5008M
Recombinant human IL-8 target Thermo Fisher Scientific, Inc. R202625
Biotinylated monoclonal mouse anti human IL-8 antibody G265-8 BD Biosciences 554718
Streptavidin coupled fluorescent protein Bio-Rad Streptavidin PE

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References

  1. Danielli, A., Arie, A., Porat, N., Ehrlich, M. Detection of fluorescent-labeled probes at sub-picomolar concentrations by magnetic modulation. Optics Express. 16, 19253-19259 (2008).
  2. Danielli, A., Porat, N., Arie, A., Ehrlich, M. Rapid homogenous detection of the Ibaraki virus NS3 cDNA at pico-molar concentrations by magnetic modulation. Biosensors and Bioelectronics. 25, 858-863 (2009).
  3. Bio-Rad "Human angiogenesis assay panel". Bio-Plex Pro. Forthcoming.
  4. Instruction Manual. Bio-Plex Precision Pro Cytokine Assay. Bio-Rad Laboratories. Hercules, CA. Forthcoming.

Comments

2 Comments

  1. In regards to the IL-8 Assay: [1] Did you have a specific concentration values on hand? [²] Is there a specific pH range that you used? [3] How did you optimize so that the target antigen would bind to both the magnetic bead and the fluorescent protein?

    Reply
    Posted by: Anonymous
    August 19, 2010 - 2:26 PM
  2. Hi Michael,
    Here are the answers to your questions:
    [1] Did you have a specific concentration values on hand?

    We made several concentrations according to the Bio-Rad kit that we used. We chose to present the results with the smallest concentration that we made.

    [²] Is there a specific pH range that you used?

    We used the assay buffer of the kit. I guess that it had the optimal ph for the reaction.

    [3] How did you optimize so that the target antigen would bind to both the magnetic bead and the fluorescent protein?

    This kit is optimized already. You may check the reference list of the JoVE manuscript and see the kit&#x²019;s specifications. For further information on the MMB system as well as on the IL-8 kit, I suggest that you look at additional paper that we published: A. Danielli, N. Porat, M. Ehrlich, and A. Arie, &#x²01C;Magnetic modulation biosensing for rapid and homogeneous detection of biological targets at low concentrations&#x²01D;, Current Pharmaceutical Biotechnology, 11, 1²8-137 (²010)

    Best regards,

    Amos Danielli

    Reply
    Posted by: Amos D.
    November 2, 2010 - 3:44 PM

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