Biyolojik Tahliller Manyetik Modülasyon Biyoalgılayıcı Sistemi kullanarak hızlı Homojen Algılama

Biology

Your institution must subscribe to JoVE's Biology section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

Welcome!

Enter your email below to get your free 10 minute trial to JoVE!





We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.

If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.

 

Summary

Manyetik modülasyon biyoalgı sistemi hızla DNA molekülleri ve proteinler gibi biyolojik testleri, hassas ve kolayca tespit etmek için kullanılmaktadır.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Danielli, A., Porat, N., Ehrlich, M., Arie, A. Rapid Homogeneous Detection of Biological Assays Using Magnetic Modulation Biosensing System. J. Vis. Exp. (40), e1935, doi:10.3791/1935 (2010).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Bir manyetik modülasyon biyoalgı sistemi (MMB) [1,2] hızlı ve homojen olarak herhangi bir yıkama veya ayrılık adım olmadan düşük konsantrasyonlarda tespit biyolojik hedefler. IL-8 hedefi varsa, 'sandwich' tabanlı test, IL-8 hedef ve bir biotinlenmiş IL-8 antikor ile birleştiğinde flüoresan protein streptavidin, IL-8 yakalama antikor manyetik boncuk bağlı. Manyetik boncuklar iki elektromanyetik kutubdan alternatif manyetik alanın gradyanı uygulayarak salınım hareketi içine manevra. Manyetik boncuk bağlı olan floresan proteinleri, dik bir lazer ışını senkron algılama kullanarak demodüle periyodik bir floresan sinyal üretir ve algılama alanı ve hareket içine yoğunlaşmış. Manyetik modülasyon biyoalgı sistemi, yapısal olmayan Ibaraki virüs protein 3 (ns3), tamamlayıcı DNA (cDNA) [2] kodlama dizileri önceden tespit etmek için kullanılır oldu. Parçacıklar dış manipülasyon ve yoğunlaşma Bu çalışmada gösterilmiştir teknikleri diğer uygulamalar, örneğin manyetik çiftli ilaçlar teslimat için kullanılan olabilir

Protocol

IL-8 tahlil:

  1. Reaksiyon karışımı kendi konsantrasyonları tahlil tampon 100 ul son hacmi aşağıdaki dört bileşenden dahildir. 10, 100 boncuk / ml nihai konsantrasyonları, 1 nano-gram/μl final konsantrasyon biotinlenmiş IL-8 antikor 2 ul, 20 nano-gram/μl final konsantrasyon streptavidin floresan protein 1 ul, yakalama antikor manyetik boncuk ul ve 1, IL-8 hedefin 0.48 pico-gram/μl ul. Bileşenler tek tek tahlil tamponu eklenir ve sonra 30 dakika boyunca sarsıldı.
  2. Bir kontrol reaksiyonu IL-8 hedef olmadan aynı şekilde hazırlanır.
  3. Tepkiler, daha sonra, herhangi bir ayrılık ya da yıkama küvetleri olmaksızın yerleştirilir ve MMB sistemi ile kontrol edilmektedir.

MMB sistemi:

  1. Elektromanyetik iki kutup arasındaki yerini küvet yerleştirin.
  2. Modülasyon akımı çalıştırın ve boncuk agregasyonu ve yoğunlaşma izin vermek için 30 saniye bekleyin
  3. Sinyal kilit amplifikatör bir osiloskop kullanarak ölçün.

Temsilcisi Sonuçlar:

Toplu boncuk Görsel inceleme hedef ve hedef olmadan reaksiyon ile tepki arasında belirgin bir fark sundu. Hedefi ile tüm reaksiyonlarda, boncuk, birleşin şekilde lazer ışını ve dışarı taşındı, tek bir yoğun agrega kurdu. Ancak, hedef olmadan tepki olarak, boncuk daha az toplu ve hareket (bkz. Şekil 1) daha az birleştirmek oldu.

Şekil 1
Şekil 1: (a) hedef olmadan sandviç 'immunoassay görsel denetim IL-8, IL-8 ile hedef (b) .

Kutuplu modülasyon saat (sarı) ve PMT çıkış sinyali (kırmızı) 0,48 gram pico-IL-8 hedef tespit ederken, (a) Şekil 1'de sunulmaktadır. Her kutup için modülasyon frekansı 2 Hz. Ancak, teorik olarak beklendiği gibi, boncuk, lazer ışını geçerken, PMT floresan ışığı algılar ve PMT çıkış voltajı bir tepe var. Bu nedenle, demodülasyon frekansı 4 Hz. PMT sinyal ve iki katına modülasyon saat (4 Hz'de) amplifikatör kilit beslenir, hassas faz dedektörü, senkronizasyon ve yüksek gerilim (bkz. Şekil 2) sonuçları algılar.

Şekil 2
Şekil 2: (a) modülasyon saat (sarı) ve PMT sinyali (kırmızı) algılama 0.48 gram pico-IL-8 hedef. (B), iki farklı taramaları amplifikatör voltaj sonuçlandı kilit.

Amplifikatör kilit kontrol örneği test edildi herhangi bir sinyal tespit etmedi. Bu durum, MMB sistemi agregasyonunda görsel fark ile birlikte IL-8 hedefin varlığı açıkça tespit düşündürmektedir.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Özetle, biz MMB sistemi düşük konsantrasyonlarda (0.5 pico-gram [3,4] Bio-Plex Precision Pro sitokin testlerin saptama sınırı), IL-8 hedefin varlığını tespit etmek için kullanılabileceğini gösterdi. Sisteminin yeteneği IL-8 ile sınırlı değildir ve diğer proteinleri tespit etmek için kullanılabilir. MMB sistemin avantajları, hızlı bir şekilde ve herhangi bir ayrılık ya da yıkama adım olmadan hedef tespit etmeye yeteneği. Bu nedenle, algılama süreci kolaylaştırır ve sistem alanında uygulamalarda kullanılmasına izin verir.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Acknowledgements

Bu çalışma kısmen Ishaya Horowitz Fonu tarafından desteklenmiştir.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Bio-Plex Pro Human Cytokine IL-8 set Bio-Rad 171-B5008M
Recombinant human IL-8 target Thermo Fisher Scientific, Inc. R202625
Biotinylated monoclonal mouse anti human IL-8 antibody G265-8 BD Biosciences 554718
Streptavidin coupled fluorescent protein Bio-Rad Streptavidin PE

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Danielli, A., Arie, A., Porat, N., Ehrlich, M. Detection of fluorescent-labeled probes at sub-picomolar concentrations by magnetic modulation. Optics Express. 16, 19253-19259 (2008).
  2. Danielli, A., Porat, N., Arie, A., Ehrlich, M. Rapid homogenous detection of the Ibaraki virus NS3 cDNA at pico-molar concentrations by magnetic modulation. Biosensors and Bioelectronics. 25, 858-863 (2009).
  3. Bio-Rad "Human angiogenesis assay panel". Bio-Plex Pro. Forthcoming.
  4. Instruction Manual. Bio-Plex Precision Pro Cytokine Assay. Bio-Rad Laboratories. Hercules, CA. Forthcoming.

Comments

2 Comments

  1. In regards to the IL-8 Assay: [1] Did you have a specific concentration values on hand? [²] Is there a specific pH range that you used? [3] How did you optimize so that the target antigen would bind to both the magnetic bead and the fluorescent protein?

    Reply
    Posted by: Anonymous
    August 19, 2010 - 2:26 PM
  2. Hi Michael,
    Here are the answers to your questions:
    [1] Did you have a specific concentration values on hand?

    We made several concentrations according to the Bio-Rad kit that we used. We chose to present the results with the smallest concentration that we made.

    [²] Is there a specific pH range that you used?

    We used the assay buffer of the kit. I guess that it had the optimal ph for the reaction.

    [3] How did you optimize so that the target antigen would bind to both the magnetic bead and the fluorescent protein?

    This kit is optimized already. You may check the reference list of the JoVE manuscript and see the kit&#x²019;s specifications. For further information on the MMB system as well as on the IL-8 kit, I suggest that you look at additional paper that we published: A. Danielli, N. Porat, M. Ehrlich, and A. Arie, &#x²01C;Magnetic modulation biosensing for rapid and homogeneous detection of biological targets at low concentrations&#x²01D;, Current Pharmaceutical Biotechnology, 11, 1²8-137 (²010)

    Best regards,

    Amos Danielli

    Reply
    Posted by: Amos D.
    November 2, 2010 - 3:44 PM

Post a Question / Comment / Request

You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

Usage Statistics