Detecção rápida de Homogêneos Ensaios Biológicos Usando o sistema de modulação Biossensoriais Magnetic

Biology

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Summary

Magnética modulação do sistema biosensoriamento é utilizada para rapidamente, com sensibilidade e simplesmente detectar ensaios biológicos, tais como moléculas de DNA e proteínas.

Cite this Article

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Danielli, A., Porat, N., Ehrlich, M., Arie, A. Rapid Homogeneous Detection of Biological Assays Using Magnetic Modulation Biosensing System. J. Vis. Exp. (40), e1935, doi:10.3791/1935 (2010).

Please note that all translations are automatically generated.

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Abstract

A modulação do sistema magnético biosensoriamento (MMB) [1,2] de forma rápida e homogênea alvos biológicos detectados em baixas concentrações sem lavar ou etapa de separação. Quando a IL-8 alvo estava presente, um "ensaio sandwich baseado esferas magnéticas associadas com IL-8 anticorpo de captura para estreptavidina acoplado a proteína fluorescente através da IL-8 alvo e um IL-8 biotinilado de anticorpos. O esferas magnéticas são manobrados em movimento oscilatório, aplicando um gradiente de campo magnético alternado através de dois pólos eletromagnéticos. As proteínas fluorescentes, que são ligados às esferas magnéticas são condensados ​​para a área de detecção e seu movimento dentro e fora de um feixe de laser ortogonal produz um sinal periódico fluorescente que é demodulado usando a detecção síncrona. O sistema de modulação biosensoriamento magnética foi usada anteriormente para detectar as seqüências de codificação das proteínas não estruturais do vírus Ibaraki 3 (NS3) DNA complementar (cDNA) [2]. As técnicas que são demonstradas neste trabalho para manipulação externa e condensação das partículas pode ser usado para outras aplicações, por exemplo, entrega de medicamentos magneticamente acoplada

Protocol

IL-8 ensaio:

  1. A mistura de reação foram as seguintes quatro componentes em 100 mL de volume final de tampão de ensaio em suas respectivas concentrações. 10 ml de esferas magnéticas com anticorpo de captura menos 100 esferas / mL concentrações final, 2 l da IL-8 anticorpo biotinilado em 1 nano-gram/μl concentração final, 1 ml de estreptavidina proteína fluorescente em 20 nano-gram/μl concentração final, e 1 mL de IL-8-alvo em 0,48 pico-gram/μl. Os componentes são adicionados um por um para o tampão de ensaio e são em seguida agitado por 30 minutos.
  2. A reação de controle é preparado da mesma maneira sem a IL-8 alvo.
  3. As reacções são depois colocados sem qualquer separação ou etapa de lavagem na cubetas e inspecionados utilizando o sistema de MMB.

Sistema de MMB:

  1. Coloque a cubeta na sua posição entre os dois pólos eletromagnéticos.
  2. Operar o atual modulação e aguarde 30 segundos para permitir a agregação e condensação das esferas
  3. Medir o sinal do amplificador lock-in usando um osciloscópio.

Resultados representativos:

Inspeção visual das contas agregadas apresentou uma nítida diferença entre a reação com o destino ea reação sem o alvo. Em todas as reações com o alvo, os grânulos formado um agregado único e denso que se movia dentro e fora do raio laser de forma unir. No entanto, em toda a reação sem o alvo, as contas eram menos agregadas e seu movimento era menos unir (ver Figura 1).

Figura 1
Figura 1: inspecção visual de imunoensaio o sanduíche '(a) sem o alvo IL-8 (b) Com o objectivo de IL-8.

O relógio de modulação pole (amarelo) eo sinal de saída PMT (magenta), enquanto a detecção de 0,48 IL-8 pico gram-alvo são apresentados na Figura 1 (a). A freqüência de modulação para cada pólo é a 2 Hz. No entanto, como era teoricamente esperado, quando as contas passar o feixe de laser, a PMT detecta a luz fluorescente e há um pico na tensão de saída PMT. Portanto, a frequência de demodulação é a 4 Hz. Quando o sinal de PMT eo relógio dobrou modulação (a 4 Hz) são alimentados para o bloqueio no amplificador, o detector de fase sensível detecta a sincronização e resultados com alta tensão (ver figura 2).

Figura 2
Figura 2: (a) do relógio, a modulação (amarelo) eo sinal de PMT (magenta) quando a detecção de 0,48 pico gram-IL-8 alvo. (B) O bloqueio resultou em tensão do amplificador de dois exames diferentes.

O bloqueio no amplificador não detectaram qualquer sinal quando a amostra controle foi testado. Este facto, juntamente com a diferença visual na agregação sugere que o sistema MMB pode identificar claramente a presença de IL-8 alvo.

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Discussion

Em resumo, nós mostramos que o sistema MMB pode ser usado para detectar a presença de IL-8-alvo em baixas concentrações (0,5 pico gram-é o limite de detecção do Bio-Plex Precision ensaios de citocinas Pro [3,4]). A capacidade do sistema não se limita a IL-8 e pode ser usado para detectar outras proteínas. As vantagens do sistema de MMB são a capacidade de detectar o alvo rapidamente e sem qualquer separação ou lavagem. Assim, facilita o processo de detecção e permite que o sistema a ser utilizado em aplicações de campo.

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Acknowledgements

Este trabalho foi parcialmente financiado pelo Fundo Horowitz Isha.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Bio-Plex Pro Human Cytokine IL-8 set Bio-Rad 171-B5008M
Recombinant human IL-8 target Thermo Fisher Scientific, Inc. R202625
Biotinylated monoclonal mouse anti human IL-8 antibody G265-8 BD Biosciences 554718
Streptavidin coupled fluorescent protein Bio-Rad Streptavidin PE

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Danielli, A., Arie, A., Porat, N., Ehrlich, M. Detection of fluorescent-labeled probes at sub-picomolar concentrations by magnetic modulation. Optics Express. 16, 19253-19259 (2008).
  2. Danielli, A., Porat, N., Arie, A., Ehrlich, M. Rapid homogenous detection of the Ibaraki virus NS3 cDNA at pico-molar concentrations by magnetic modulation. Biosensors and Bioelectronics. 25, 858-863 (2009).
  3. Bio-Rad "Human angiogenesis assay panel". Bio-Plex Pro. Forthcoming.
  4. Instruction Manual. Bio-Plex Precision Pro Cytokine Assay. Bio-Rad Laboratories. Hercules, CA. Forthcoming.

Comments

2 Comments

  1. In regards to the IL-8 Assay: [1] Did you have a specific concentration values on hand? [²] Is there a specific pH range that you used? [3] How did you optimize so that the target antigen would bind to both the magnetic bead and the fluorescent protein?

    Reply
    Posted by: Anonymous
    August 19, 2010 - 2:26 PM
  2. Hi Michael,
    Here are the answers to your questions:
    [1] Did you have a specific concentration values on hand?

    We made several concentrations according to the Bio-Rad kit that we used. We chose to present the results with the smallest concentration that we made.

    [²] Is there a specific pH range that you used?

    We used the assay buffer of the kit. I guess that it had the optimal ph for the reaction.

    [3] How did you optimize so that the target antigen would bind to both the magnetic bead and the fluorescent protein?

    This kit is optimized already. You may check the reference list of the JoVE manuscript and see the kit&#x²019;s specifications. For further information on the MMB system as well as on the IL-8 kit, I suggest that you look at additional paper that we published: A. Danielli, N. Porat, M. Ehrlich, and A. Arie, &#x²01C;Magnetic modulation biosensing for rapid and homogeneous detection of biological targets at low concentrations&#x²01D;, Current Pharmaceutical Biotechnology, 11, 1²8-137 (²010)

    Best regards,

    Amos Danielli

    Reply
    Posted by: Amos D.
    November 2, 2010 - 3:44 PM

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