Homogène de détection rapide des essais biologiques utilisant un support magnétique Système de modulation Biosensing

Biology

Your institution must subscribe to JoVE's Biology section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

Magnétique de modulation biodétection système est utilisé pour rapidement, avec tact et simplement de détecter des dosages biologiques, tels que les molécules d'ADN et des protéines.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Danielli, A., Porat, N., Ehrlich, M., Arie, A. Rapid Homogeneous Detection of Biological Assays Using Magnetic Modulation Biosensing System. J. Vis. Exp. (40), e1935, doi:10.3791/1935 (2010).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Un système de modulation magnétique biodétection (MMB) [1,2] rapide et homogène détecté cibles biologiques à de faibles concentrations sans aucun lavage ou étape de séparation. Lorsque l'IL-8 cible a été présent, une «sandwich' essai basé sur des billes magnétiques attachés avec de l'IL-8 anticorps de capture à la streptavidine couplée protéine fluorescente via l'IL-8 et un objectif de l'IL-8 biotinylé anticorps. Les billes magnétiques sont manoeuvré en mouvement oscillatoire en appliquant un gradient de champ magnétique alternatif à travers deux pôles électromagnétiques. Les protéines fluorescentes, qui sont attachés aux billes magnétiques sont condensés dans la zone de détection et leur mouvement dans et hors d'un rayon laser orthogonaux produit un signal périodique fluorescent qui est démodulé en utilisant la détection synchrone. Le système de modulation magnétique biodétection a été précédemment utilisé pour détecter les séquences codantes de la protéine non structurale du virus Ibaraki 3 (NS3) de l'ADN complémentaire (ADNc) [2]. Les techniques qui sont mises en évidence dans ce travail pour la manipulation extérieure et la condensation des particules peut être utilisé pour d'autres applications, par exemple la livraison de médicaments à accouplement magnétique

Protocol

IL-8 d'essai:

  1. Le mélange réactionnel comprenait les quatre composantes suivantes dans 100 ul volume final de tampon de dosage de leurs concentrations respectives. 10 ul de billes magnétiques avec des anticorps de capture à 100 billes / ul concentrations finales, 2 pl de l'IL-8 biotinylé anticorps à une concentration finale nano-gram/μl, 1 pl de streptavidine protéine fluorescente à 20 concentration finale nano-gram/μl, et 1 ul d'IL-8 cible à 0,48 pico-gram/μl. Les composants sont ajoutés un par un à la mémoire tampon de dosage et sont ensuite agité pendant 30 minutes.
  2. Une réaction de contrôle est préparé de la même manière sans l'IL-8 cible.
  3. Les réactions sont placés plus tard sans aucune séparation ou de lavage dans les cuvettes et inspectés en utilisant le système MMB.

Système de MMB:

  1. Placer la cuvette dans sa position entre les deux pôles électromagnétiques.
  2. Actionnez le courant de modulation et d'attendre 30 secondes pour permettre l'agrégation et la condensation des perles
  3. Mesurer le signal de l'amplificateur lock-in à l'aide d'un oscilloscope.

Les résultats représentatifs:

L'inspection visuelle des grains agrégés présenté une nette différence entre la réaction avec la cible et la réaction sans la cible. Dans toutes les réactions avec la cible, les billes ont formé un seul agrégat dense qui se déplaçait dans et hors le faisceau laser de manière à s'unir. Cependant, dans tous la réaction sans la cible, les billes sont moins regroupées et leur mouvement a été moins s'unir (voir Figure 1).

Figure 1
Figure 1: inspection visuelle de l'immuno-sandwich "(a) sans la cible IL-8 (b) Avec la cible d'IL-8.

L'horloge de modulation poteau (jaune) et le signal de sortie du PMT (magenta) tout en détectant 0,48 pico-grammes d'IL-8 cibles sont présentés dans la figure 1 (a). La fréquence de modulation pour chaque pôle est à 2 Hz. Toutefois, comme il était théoriquement prévu, lorsque les billes passer le faisceau laser, le PMT détecte la lumière fluorescente et il ya un pic dans la tension de sortie du PMT. Par conséquent, la fréquence de démodulation est à 4 Hz. Lorsque le signal du PMT et l'horloge doublé de modulation (à 4 Hz) sont nourris à l'écluse de l'amplificateur, le détecteur de phase sensible détecte la synchronisation et les résultats à haute tension (voir Figure 2).

Figure 2
Figure 2: (a) l'horloge de modulation (en jaune) et le signal de PMT (magenta) lorsque la détection 0,48 pico-grammes d'IL-8 cible. (B) Le blocage a entraîné tension de l'amplificateur à deux scans différents.

Le verrouillage de l'amplificateur n'a pas détecté de signal lorsque l'échantillon de contrôle a été testé. Ce fait, avec la différence visuelle dans l'agrégation suggère que le système MMB peut clairement identifier la présence d'IL-8 cible.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

En résumé, nous avons montré que le système MMB peut être utilisé pour détecter la présence d'IL-8 cibles à faible concentration (0,5 pico-gramme est la limite de détection des tests de précision Bio-Plex cytokine pro [3,4]). La capacité du système ne se limite pas à l'IL-8 et peut être utilisé pour détecter d'autres protéines. Les avantages du système MMB sont la capacité à détecter la cible rapidement et sans aucune séparation ou de lavage. Ainsi, il facilite le processus de détection et permet au système d'être utilisé dans les applications de terrain.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Acknowledgements

Ce travail a été partiellement financé par le Fonds Ishaya Horowitz.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Bio-Plex Pro Human Cytokine IL-8 set Bio-Rad 171-B5008M
Recombinant human IL-8 target Thermo Fisher Scientific, Inc. R202625
Biotinylated monoclonal mouse anti human IL-8 antibody G265-8 BD Biosciences 554718
Streptavidin coupled fluorescent protein Bio-Rad Streptavidin PE

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Danielli, A., Arie, A., Porat, N., Ehrlich, M. Detection of fluorescent-labeled probes at sub-picomolar concentrations by magnetic modulation. Optics Express. 16, 19253-19259 (2008).
  2. Danielli, A., Porat, N., Arie, A., Ehrlich, M. Rapid homogenous detection of the Ibaraki virus NS3 cDNA at pico-molar concentrations by magnetic modulation. Biosensors and Bioelectronics. 25, 858-863 (2009).
  3. Bio-Rad "Human angiogenesis assay panel". Bio-Plex Pro. Forthcoming.
  4. Instruction Manual. Bio-Plex Precision Pro Cytokine Assay. Bio-Rad Laboratories. Hercules, CA. Forthcoming.

Comments

2 Comments

  1. In regards to the IL-8 Assay: [1] Did you have a specific concentration values on hand? [²] Is there a specific pH range that you used? [3] How did you optimize so that the target antigen would bind to both the magnetic bead and the fluorescent protein?

    Reply
    Posted by: Anonymous
    August 19, 2010 - 2:26 PM
  2. Hi Michael,
    Here are the answers to your questions:
    [1] Did you have a specific concentration values on hand?

    We made several concentrations according to the Bio-Rad kit that we used. We chose to present the results with the smallest concentration that we made.

    [²] Is there a specific pH range that you used?

    We used the assay buffer of the kit. I guess that it had the optimal ph for the reaction.

    [3] How did you optimize so that the target antigen would bind to both the magnetic bead and the fluorescent protein?

    This kit is optimized already. You may check the reference list of the JoVE manuscript and see the kit&#x²019;s specifications. For further information on the MMB system as well as on the IL-8 kit, I suggest that you look at additional paper that we published: A. Danielli, N. Porat, M. Ehrlich, and A. Arie, &#x²01C;Magnetic modulation biosensing for rapid and homogeneous detection of biological targets at low concentrations&#x²01D;, Current Pharmaceutical Biotechnology, 11, 1²8-137 (²010)

    Best regards,

    Amos Danielli

    Reply
    Posted by: Amos D.
    November 2, 2010 - 3:44 PM

Post a Question / Comment / Request

You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

Usage Statistics