In situ subcellulära Fraktionering av vidhäftande och icke-häftande däggdjursceller

Published 7/23/2010
0 Comments
  CITE THIS  SHARE 
Biology

Your institution must subscribe to JoVE's Biology section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

Welcome!

Enter your email below to get your free 10 minute trial to JoVE!





By clicking "Submit", you agree to our policies.

 

Summary

In situ subcellulära fraktionering av däggdjursceller på mikroskop täckglas tillåter visualisering av protein lokalisering.

Cite this Article

Copy Citation

Sawasdichai, A., Chen, H., Abdul Hamid, N., Jayaraman, P., Gaston, K. In situ Subcellular Fractionation of Adherent and Non-adherent Mammalian Cells. J. Vis. Exp. (41), e1958, doi:10.3791/1958 (2010).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Proteiners funktion är intimt kopplad till protein lokalisering. Även om vissa proteiner är begränsade till en viss plats eller subcellulära fack, många proteiner är närvarande som ett fritt diffuserande befolkningen i fritt utbyte med en delpopulation som är tätt förknippad med en viss subcellulära domän eller struktur. In situ subcellulära fraktionering tillåter visualisering av protein uppdelning och kan också avslöja protein delpopulationer som lokaliserar till specifika strukturer. Till exempel kan borttagning av lösliga cytoplasmiska proteiner och löst höll nukleära proteiner avslöja stabil sammanslutning av vissa transkriptionsfaktorer med kromatin. Efter rötning av DNA kan i vissa fall avslöja samband med det nätverk av proteiner och RNA som kollektivt kallas den nukleära schavotten eller nukleära matris.

Här beskriver vi de åtgärder som krävs vid in situ fraktionering av anhängare och icke-häftande däggdjursceller på mikroskop täckglas. Protein visualisering kan uppnås med hjälp av specifika antikroppar eller fluorescerande proteiner fusion och fluorescensmikroskopi. Antikroppar och / eller fluorescerande färger som fungerar som markörer för specifika utrymmen eller strukturer kan protein lokalisering kan kartläggas i detalj. In situ fraktionering också kan kombineras med Western blotting för att jämföra mängden protein som finns i varje fraktion. Denna enkla biokemiska angreppssätt kan avslöja föreningar som annars skulle förbli oupptäckta.

Protocol

I. Förberedelse för fraktionering

Detta avsnitt beskriver förberedelserna av poly-L-lysin belagda mikroskop täckglas och fastsättning av celler innan fraktionering. Vid behov cellerna kan tillfälligt transfererats med vektorer proteinuttryck antingen före eller efter fastsättning.

A. Beredning av poly-L-lysin belagd täckglas

  1. Bered en lösning av 1mg/ml poly-L-lysin i destillerat vatten.
  2. Coat rena täckglas med poly-L-lysin genom att inkubera dem i lösningen i minst 1 timme på en gungande plattform vid 22 ° C.
  3. Tvätta belagda täckglas med sterilt destillerat vatten två gånger och följ med en enda tvätta med 96% etanol.
  4. Lufttorka belagda täckglas på en bit filtrerpapper och förvara dem på en torr behållare för framtida användning (när torra de kan staplas).

B. Montering celler till täckglas

Icke-häftande celler (Här använder vi K562-celler)

  1. Placera en poly-L-lysin belagda täckglas i en brunn i en 6-brunnar med den belagda ytan uppåt.
  2. Seed K562 celler med en täthet av 7x10 5 celler / brunn i Dulbecco ändrade Eagles Medium (DMEM) kompletteras med 10% fetalt bovint serum (FBS) och PS (penicillin 100units/ml, streptomycin 100mg/ml). När det gäller K562 celler övergående transfektion kan utföras med hjälp av elektroporation (0.4cm elektroporation kyvetter med 1x10 7 celler i 200μl av media på 250V / 975μF) innan sådd cellerna.
  3. Inkubera cellerna i 24 timmar vid 37 ° C i 5% CO 2.
  4. Häll av mediet och tvätta cellerna två gånger med iskallt fosfatbuffrad saltlösning (PBS).
  5. Följ med subcellulära fraktionering protokollet.

Vidhäftande celler (här använder vi Cos-7 celler)

  1. Placera ett obestruket täckglas i en brunn i en 6-brunnar.
  2. Tvätta två gånger i PBS uppvärmd vid 37 ° C.
  3. Lossa cellerna genom uppslutning med trypsin (0,03% EDTA, 0,25% trypsin) i PBS vid 37 ° C i 2 till 5 minuter. Det är viktigt att inte över-smälta celler och för att stoppa matsmältningen så snart som huvudsakligen enskilda flytande celler är närvarande.
  4. Stoppa matsmältningen genom att seeda celler vid en densitet av 3x10 5 celler / brunn i en 6-brunnar i DMEM kompletterad med 10% FBS och PSG (penicillin 100 enheter / ml streptomycin 100ug/ml och L-glutamin 292ug/ml) , på normala täckglas. Vidhäftande celler fäster i allmänhet väl på normala mikroskop täckglas, men kan poly-L-Lysin belagda täckglas användas vid behov.
  5. Inkubera cellerna i 24 timmar vid 37 ° C och 5% CO 2. Vid Cos-7 celler transient transfektion kan utföras med Fugene 6 (Roche) om det behövs och cellerna kvar att återhämta sig i ytterligare 24 timmar vid 37 ° C och 5% CO 2.
  6. Häll av mediet och tvätta cellerna två gånger med iskallt PBS.
  7. Följ med subcellulära fraktionering protokollet.

II. Subcellulära fraktionering

In situ fraktion utförs enligt schemat som visas i figur 1 och bygger på en metod som beskrivs tidigare 5 med ändringar beskrevs tidigare 7 och i den detaljerade protokollet nedan. Det rekommenderas att överföra täckglasen till en ny 6-brunnar efter varje fraktionering steg att ta bort täckglaset innan du tar bort vätskan. Även om endast fyra täckglas krävs för bildhantering, är ytterligare täckglas krävs för att producera hela cellextrakt och nukleära fraktioner matris för Western blotting om detta ska ske parallellt.

  1. Förbered och filter cytoskelettet buffert (CSK): 10mm RÖR, 300mm Sackaros, 100mm NaCl, 3 mm MgCl 2, 1mm EGTA. CSK buffert bör beredas på dagen för fraktionering.
  2. Vid behov celler från ett täckglas kan användas för att förbereda hela cellextrakt för Western blotting genom att försiktigt placera 200ul TES buffert (1% SDS, 2mm EDTA, 20mm Tris-HCl pH 7,4) direkt på täckglas och inkubation under 1 eller 2 minuter vid 22 ° C. Hela cellextrakt kan sedan tas bort och de proteiner fälls ut genom att lägga 250ul 1 M (NH 4) 2 SO 4 och ruva på is tills den andra västliga proverna är klara.
  3. Tvätta den återstående täckglas med 1 ml iskall PBS två gånger vid 22 ° C genom att vinkla 6 väl platta två eller tre gånger.
  4. Ta bort täckglas som representerar hela celler och överför till en ny 6-brunnar. Följ med cellen fixering och immuno-fluorescens protokollet.
  5. Ta försiktigt av PBS från återstående brunnarna.
  6. Extrahera cytoplasmiska och löst hålls nukleära proteiner genom att försiktigt placera 200ul CSK buffert + 0,1% (v / v) Triton X-100 direkt på varje återstående täckglas och ruva påis i 1 minut.
  7. Ta bort cytoplasmiska och löst höll nukleära extrakt och fällningen som beskrivs i steg 2.
  8. Tvätta täckglas med 1 ml iskall PBS två gånger vid 22 ° C genom att vinkla 6 väl plattan.
  9. Ta bort täckglas representerar hårt höll kärnämne och följ med cellen fixering och immuno-fluorescens protokollet.
  10. Ta försiktigt av PBS från återstående brunnarna sedan extrahera tätt hålls proteiner genom att försiktigt placera 200ul CSK buffert + 0,5% (v / v) Triton X-100 direkt på varje återstående täckglas och ruva på is i 20 minuter.
  11. Ta bort tätt höll extrakt och fällningen som beskrivs i steg 2.
  12. Tvätta täckglas med 1 ml iskall PBS två gånger vid 22 ° C genom att vinkla 6 väl plattan.
  13. Ta bort täckglas representerar kromatin fraktionen och följ med cellen fixering och immuno-fluorescens protokollet.
  14. Ta försiktigt av PBS från återstående brunnarna sedan placera 200ul CSK buffert + 100ug/ml av DNas jag på resterande täckglas och inkubera i 30 minuter vid 37 ° C.
  15. Ta bort kromatin extrakt och fällningen som beskrivs i steg 2.
  16. Tvätta täckglas med iskallt PBS två gånger vid 22 ° C genom att vinkla 6 väl plattan.
  17. Ta bort täckglas som representerar den nukleära matrix fraktionen och följ med cellen fixering och immuno-fluorescens protokollet.
  18. Om det behövs matrisen proteiner kan tas bort från en extra matris täckglas för Western blotting med 200ul TES buffert som beskrivs i steg 2.
  19. Prover för Western Blot bör centrifugeras vid 13 tusen varv i en bänk mikrocentrifug vid 4 ° C och pellets återsuspenderade i 40ul SDS buffert (62.5mM Tris-HCl pH 6,8, 2% SDS (v / v), 50 mm DTT, 10% glycerol, 0,01% Bromfenolblått (w / v)) före analys med SDS-PAGE
    Figur 1
    Figur 1. En schematisk bild av in situ subcellulära fraktionering. Cytoskelettet buffert (CSK) består av 10 mM RÖR, 300mm Sackaros, 100mm NaCl, 3 mm MgCl 2, 1mm EGTA. TES buffert består av 1% SDS, 2mm EDTA, 20mm Tris-HCl pH 7,4.

III. Cell fixering och immuno-fluorescens

  1. Tillsätt försiktigt 1 ml 4% formaldehyd / PBS till varje täckglas och inkubera vid 4 ° C i 30 minuter.
  2. Tvätta varje täckglas försiktigt 2-3 gånger med 1 ml PBS vid 22 ° C.
  3. Lägg 400ul på 0,1% Triton X-100/PBS till varje täckglas och inkubera vid 22 ° C i 10 minuter.
  4. Tvätta varje täckglas försiktigt 2-3 gånger med 1 ml PBS vid 22 ° C.
  5. Tillsätt 400ul 3% bovint serumalbumin (BSA) / PBS och inkubera vid 22 ° C i 20 minuter för att minska potentiella bakgrundsfärgning.
  6. Tvätta varje täckglas försiktigt 2-3 gånger med 1 ml PBS vid 22 ° C.
  7. Placera 100ul av den primära antikroppen i PBS direkt på täckglas och inkubera vid 22 ° C i 1 timme. Primära och sekundära antikroppar bör spädas i PBS till önskad koncentration. Detta kan behöva optimeras för varje använd antikropp.
  8. Tvätta varje täckglas försiktigt 2-3 gånger med 1 ml PBS vid 22 ° C.
  9. Plats 200ul av sekundära antikroppar i PBS och inkubera vid 22 ° C borta från ljus i 1 timme.
  10. Tvätta varje täckglas försiktigt 2-3 gånger med 1 ml PBS vid 22 ° C.
  11. Montera varje täckglas (celler nedåt) på ett glas objektglas med Vectashield monteringsmedium innehåller DAPI (4 ',6-diamidino-2-phenylindole hydroklorid).
  12. Torka överskott monteringsmedium från hela täckglas med en pappershandduk och inkubera i bilden vid 22 ° C i minst 30 minuter från ljus.
  13. Fäst täckglas till glasskiva med klar polish akryl spik.
  14. Håll bilderna borta från ljus innan visualisering av fluorescensmikroskopi.

IV. Representativa resultat

Figur 2
Figur 2. Subcellulära fraktionering av icke-transfekterade COS-7 celler. Fraktionerade Cos-7 celler har fastställts med formaldehyd och immunostained använda α-tubulin, α-Histon H1 eller α-Lamin A / C antikroppar konjugerade med TRITC följt av behandling med montering medium som innehåller DAPI . Bilder förvärvades med 10x okularlinsen och 63x objektivet med hjälp av en Leica konfokalmikroskop. Cellkärnan var visualiseras med en DAPI filter in när samma område cellerna färgas med markör antikroppar visualiseras med en TRITC filter set.

Figur 3
Figur 3. En GFP-6E2 fusionsprotein är förknippad med den nukleära matrisen. Subcellulära fraktionering av Cos-7 celler som uttrycker en fusionsprotein bestående av grönt fluorescerande protein (GFP) smält till humant papillomavirus (HPV) typ 6E2 protein (GFP-6E2). Cellkärnan var visualiseras via DAPI färgning medan lokalisering av GFP-6E2 i transfekterade cellerna var direkt visualiseras via GFP fluorescens. Lamin A / C visualiserades med hjälp av α-Lamin A / C antikroppar konjugerade till TRITC och en TRITC filter set. Sammanslagningen bilder avslöjar att några av GFP-6E2 protein är associerad med den nukleära matrisen (nedre högra panelen). Bilder erhölls som beskrivs i figur 2.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Vanliga problem och förslag:

Alla eller de flesta av cellerna försvinner vid tvätt. Under tvättsteg vätskor måste tillsättas långsamt till sidan av 6-brunnar undvika täckglas. Likaså vätskor bör avlägsnas genom att försiktigt luta plattan och långsamt pipettera bort överflödig vätska. Celladhesion kan ökas med hjälp av poly-L-Lysin belagda täckglas.

Genomisk DNA är inte helt smält. För vissa celltyper i DNAse jag matsmältningen steg kan behöva utökas och / eller DNAse jag koncentrationen ökas för att uppnå fullständig borttagning av arvsmassans DNA.

Fixering och artefakter fraktionering. Det är viktigt att notera att vissa proteiner kan relocalize under fixering eller fraktionering 6. Proteiner frigörs från kärnan efter avbrott i cellens membran till exempel kan binda till platser som annars skulle placeras i väl åtskilda fack. Dessa effekter kan minimeras genom att jämföra resultaten med olika fixation metoder till exempel med hjälp av paraformaldehyd i stället för formaldehyd. Levande cell imaging kan också vara till hjälp för hela celler minst 3.

Denna teknik lämpar sig väl för upptäckten av GFP fusionsproteiner. Det är dock viktigt att bekräfta att fusionsprotein beter sig på ett liknande sätt som omärkta protein. Det är också viktigt att bekräfta genom titrering att proteinerna uttrycks på jämförbara nivåer sedan protein över-uttryck kan förändra dramatiskt sub-cellulära lokalisering.

Tillämpningar av tekniken:

Detta underutnyttjade teknik gör protein lokalisering som skall fastställas med hänvisning till väl karaktäriserad markörer av olika subcellulära domäner eller strukturer och har tillämpningar inom många områden av cellbiologi. Till exempel har många transkriptionsfaktorer visar en komplex distribution med lokalisering till cytoplasman, löst höll nucleoplasm, kromatin och / eller nukleära matrix 1,2,4. Lokalisering i alla dessa områden kan påverka proteiners funktion samt proteinomsättningen och post-translationella modifieringar.

Protein co-lokalisering till specifika områden som den nukleära matrix kan ge kunskap om hur proteiner fungerar. Protein re-lokalisering som svar på specifika signaler och / eller ett uttryck av partner proteiner kan också belysa 1,4 proteiners funktion.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Inga intressekonflikter deklareras.

Acknowledgements

Anyaporn Sawasdichai och Nazefah Abdul Hamid är tacksamma mot den thailändska regeringen och Malaysias regering respektive för doktorsexamen Stipendier. Detta arbete har finansierats av ett Wellcome Trust projektbidrag beviljas till PSJ och KG. Vi är också tacksamma till University of Bristol Wolfson Bioimaging Facility.

Materials

Name Type Company Catalog Number Comments
BSA Chemical Sigma-Aldrich A9647-100G
DNase I Chemical Sigma-Aldrich DN25-1G
poly-L-Lysine Chemical Sigma-Aldrich P-8920
Trypsin Chemical
EGTA Chemical Sigma-Aldrich E4378-25G
Fomaldehyde Chemical VWR 284216N
PIPES Chemical Sigma-Aldrich P-6757
Sucrose Chemical Fisher Scientific S/8600/53
Triton X-100 Chemical Sigma-Aldrich T-6876
Mounting Medium with DAPI Chemical Vector Laboratories H-1200
Fugene 6 Transfection Reagent Chemical Roche Group 11814443001
Histone H1 Antibodies Santa Cruz Biotechnology, Inc. SC-8030
Lamin A/C Antibodies Santa Cruz Biotechnology, Inc. SC-20681
Tubulin-α Antibodies Santa Cruz Biotechnology, Inc. SC-32293

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Donaldson, M. M., Boner, W., Morgan, I. M. TopBP1 regulates human papillomavirus type 16 E2 interaction with chromatin. J Virol. 81, 4338-4342 (2007).
  2. Javed, A., Guo, B., Hiebert, S., Choi, J. Y., Green, J., Zhao, S. C., Osborne, M. A., Stifani, S., Stein, J. L., Lian, J. B., van Wijnen, A. J., Stein, G. S. Groucho/TLE/R-esp proteins associate with the nuclear matrix and repress RUNX (CBF(alpha)/AML/PEBP2(alpha)) dependent activation of tissue-specific gene transcription. J Cell Sci. 113, 2221-2231 (2000).
  3. Kowalczyk, A. M., Roeder, G. E., Green, K., Stephens, D. J., Gaston, K. Measuring the induction or inhibition of apoptosis by HPV proteins. Methods Mol. Med. 119, 419-432 (2005).
  4. McLarren, K. W., Theriault, F. M., Stifani, S. Association with the nuclear matrix and interaction with Groucho and RUNX proteins regulate the transcription repression activity of the basic helix loop helix factor Hes1. J Biol. Chem. 276, 1578-1584 (2001).
  5. McNeil, S., Guo, B., Stein, J. L., Lian, J. B., Bushmeyer, S., Seto, E., Atchison, M. L., Penman, S., van Wijnen, A. J., Stein, G. S. Targeting of the YY1 transcription factor to the nucleolus and the nuclear matrix in situ: the C-terminus is a principal determinant for nuclear trafficking. J Cell Biochem. 68, 500-510 (1998).
  6. Melan, M. A., Sluder, G. Redistribution and differential extraction of soluble proteins in permeabilized cultured cells. Implications for immunofluorescence microscopy. J Cell Sci. 101, 731-743 (1992).
  7. Zou, N., Lin, B. Y., Duan, F., Lee, K. Y., Jin, G., Guan, R., Yao, G., Lefkowitz, E. J., Broker, T. R., Chow, L. T. The hinge of the human papillomavirus type 11 E2 protein contains major determinants for nuclear localization and nuclear matrix association. J. Virol. 74, 3761-3770 (2000).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Video Stats